环烷烃融入锁式核酸的2′,4′桥结构中：增强核酸酶稳定性、减少磷酸硫酯修饰，并降低反义寡核苷酸的肝毒性

《JACS Au》：Cycloalkane Incorporation Into the 2′,4′-Bridge of Locked Nucleic Acid: Enhancing Nuclease Stability, Reducing Phosphorothioate Modifications, and Lowering Hepatotoxicity in Antisense Oligonucleotides

反义寡核苷酸（ASO）通过引入spirocyclopropyl和spirocyclopentyl桥接结构（scpBNA/scpBNA2）显著提升核酸酶稳定性，同时降低肝毒性风险，体外/体内实验验证其与BNA/LNA等效的RNA沉默活性且PS修饰减少不影响疗效。

　　在当今生物医学研究领域，antisense oligonucleotides（ASOs）作为一种重要的基因调控工具，已广泛应用于多种疾病的治疗研究中。ASOs是短链的核苷酸序列，设计用于与特定的mRNA互补配对，从而通过多种机制调控基因表达。然而，由于天然ASOs在体内易被核酸酶降解，其应用受到限制。因此，科学家们致力于开发化学修饰技术，以提高ASOs的稳定性和活性，同时降低其潜在的毒副作用。

一种常见的修饰方式是引入磷硫键（Phosphorothioate, PS）连接，这种修饰能够增强ASOs的抗核酸酶能力，同时促进其在细胞内的摄取和与血浆蛋白的结合，从而减少其通过肾脏快速排泄的可能性。然而，PS修饰也带来了显著的肝毒性风险，这使得开发更为安全且高效的ASO成为迫切需求。为了克服这一问题，研究者们探索了多种结构修饰，其中2′-O,4′-C-甲基桥接核苷酸（2′,4′-BNA）因其显著增强与目标RNA形成双链的能力而被广泛使用。然而，其核酸酶稳定性仍有限，需要与PS修饰结合使用，尽管这可能引发不良反应。

在此背景下，研究团队开发了一种新的修饰策略，即2′-O,4′-C-螺环戊烯桥接核苷酸（scpBNA），该结构引入了一个环戊烷环，避免了2′,4′-BNA中可能产生的立体异构中心，从而在保持双链形成能力的同时，显著提高了核酸酶稳定性。进一步，他们又开发了scpBNA2，这是一种通过螺环戊烯桥接的核苷酸，其稳定性甚至优于scpBNA。这些新型修饰的ASOs不仅在体外表现出与传统2′,4′-BNA/LNA修饰ASOs相似的活性，而且在减少PS修饰后仍能维持有效的RNA敲除能力，同时显著降低肝毒性。这种特性使得scpBNA和scpBNA2成为开发更安全、更有效的ASO药物的有前景选择。

研究通过一系列实验验证了scpBNA2的优异性能。首先，他们合成了scpBNA2-T和scpBNA2-mC的磷酸化核苷酸，并将其引入gapmer型ASOs中。通过紫外熔解实验，他们评估了这些ASOs与互补单链RNA（ssRNA）和DNA（ssDNA）形成双链的热稳定性。结果表明，scpBNA2修饰的ASOs在与ssRNA形成双链时表现出与2′,4′-BNA/LNA相似的热稳定性，而在与ssDNA结合时则略有降低。这种差异可能源于环戊烷基团在DNA双链中的立体影响，而该基团在RNA双链中则位于双链外部，对形成能力影响较小。

为了进一步验证scpBNA2在抗核酸酶能力方面的优势，研究团队还测试了其在3′-外切酶（svPDE）作用下的稳定性。结果显示，scpBNA2修饰的ASOs比scpBNA和2′,4′-BNA/LNA修饰的ASOs表现出更高的稳定性。具体而言，在40分钟的降解实验中，scpBNA2修饰的ASOs仍有71%保持完整，而scpBNA修饰的ASOs仅有31%。这一发现表明，scpBNA2的结构特性能够有效阻断核酸酶对3′-端磷酸二酯键的识别，从而显著延长其在体内的半衰期。

在体外活性测试中，scpBNA2修饰的ASOs被用于敲除小鼠Malat1基因的表达。结果显示，即使在减少PS修饰的情况下，这些ASOs仍能维持与2′,4′-BNA/LNA修饰ASOs相当的活性。相比之下，减少PS修饰的2′,4′-BNA/LNA修饰ASOs则表现出显著的活性下降。这一结果强调了scpBNA和scpBNA2在减少PS修饰的同时，仍能保持高效的RNA靶向能力，可能与其更强的抗核酸酶特性有关。

此外，研究团队还评估了scpBNA和scpBNA2在体内对肝毒性的潜在影响。他们选择了一种已知会导致严重肝毒性的2′,4′-BNA/LNA修饰ASO（ON22），并将其翼区的修饰替换为scpBNA（ON23）和scpBNA2（ON24）。在单次腹腔注射后，96小时的观察显示，ON23和ON24的处理并未导致小鼠死亡，而ON22则导致所有接受其治疗的小鼠在96小时内死亡。血清中的ALT和AST水平在ON23和ON24处理组中仅轻微升高，而对照组则保持正常。这表明，scpBNA和scpBNA2的引入可以显著降低ASO的肝毒性，可能与其结构特性减少了与细胞蛋白的相互作用有关。

进一步的研究还涉及了另一个靶点，即Nr3c1基因，使用scpBNA和scpBNA2修饰的ASO（ON34和ON35）与2′,4′-BNA/LNA修饰的ASO（ON30）相比，同样表现出高效的RNA敲除能力，但未引起肝毒性。这一发现进一步支持了scpBNA和scpBNA2在降低肝毒性方面的有效性。值得注意的是，尽管scpBNA和scpBNA2修饰的ASO在减少PS含量的情况下仍能保持良好的活性，但某些情况下（如ON31，含六条PO连接的ASO）则表现出活性和毒性均较低的结果。这可能是因为PO连接的增多导致了更快的肾脏排泄，以及更少的细胞内摄取，从而降低了其对目标RNA的作用效果。

研究团队通过这些实验，验证了scpBNA和scpBNA2在提高ASO稳定性和活性的同时，能够有效降低其肝毒性。这种修饰策略不仅提升了ASO的治疗窗口，还为开发更安全的基因治疗药物提供了新的思路。此外，他们的研究还表明，即使在不同的ASO序列中，scpBNA的引入也能显著改善其安全性，这为未来的研究和临床应用提供了重要的参考。

总的来说，这项研究揭示了scpBNA和scpBNA2在ASO设计中的独特优势。它们不仅在体外和体内均表现出良好的活性，还能显著增强ASO的抗核酸酶能力，从而减少对PS修饰的依赖。同时，这些修饰还有效降低了ASO的肝毒性，这在许多需要长期给药或高剂量治疗的应用中尤为重要。因此，scpBNA和scpBNA2代表了一种更为安全和有效的ASO修饰策略，有望在未来成为基因治疗领域的重要工具。