具有特定硫酸化模式的岩藻糖化软骨素硫酸多糖的酶法合成及抗凝活性评估

《JACS Au》：Enzymatic Synthesis and Anticoagulant Evaluation of Fucosylated Chondroitin Sulfate Polysaccharides with Defined Sulfation Patterns

硫酸化软骨素硫酸酶法合成及其抗凝血机制研究。通过BfFKP和Hpα1,3-FucTM酶构建级联反应体系，成功制备具有不同硫酸化模式的FCS多糖，发现2,4-二硫酸化FCS（F2S4S-CSA）抗凝血活性显著优于天然FCS和低分子肝素，其机制为硫酸基通过静电作用特异性结合FIXa的Arg和Lys残基，抑制FX酶复合物形成。

　　本研究聚焦于一种名为岩藻糖基化硫酸软骨素（Fucosylated Chondroitin Sulfate, FCS）的特殊糖胺聚糖（Glycosaminoglycan, GAG），其在抗凝血领域展现出独特的优势。与传统的抗凝药物如肝素和低分子量肝素（Low Molecular Weight Heparin, LMWH）相比，FCS不仅具有显著的抗凝活性，还表现出较低的出血风险。然而，天然FCS的结构复杂且高度异质，这给其在药物开发中的应用带来了巨大挑战。因此，研究团队致力于开发一种高效的合成方法，以实现FCS结构的精确控制，并进一步揭示其抗凝机制。

FCS的结构主要由硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate, CS）的主链和连接于葡萄糖醛酸（Glucuronic Acid, GlcA）3-羟基上的岩藻糖（Fucose）侧链组成。主链由β-1,4-连接的N-乙酰半乳糖胺（N-acetyl-D-galactosamine, GalNAc）和β-1,2-或β-1,3-连接的葡萄糖醛酸重复单元构成。这些结构特征赋予了FCS独特的生物学功能。然而，天然FCS由于其复杂的结构异质性，难以在药物开发中获得高纯度、结构均一的样品。为了解决这一问题，研究团队设计了一种酶催化系统，通过双功能酶L-岩藻糖激酶-GDP-岩藻糖焦磷酸酶（BfFKP）和α1–3-岩藻糖基转移酶突变体（Hpα1,3-FucTM）的协同作用，成功合成了具有特定硫酸化和岩藻糖基化模式的FCS多糖。通过该方法，研究人员合成了四种不同结构的FCS多糖：α1–3连接的岩藻糖（FCS_A）、4-硫酸化岩藻糖（F4SCSA）、2,4-双硫酸化岩藻糖（F2S4SCSA）以及自然样混合硫酸化岩藻糖（FNMSCSA）。其中，F2S4SCSA展现出卓越的抗凝活性，其效果显著优于临床常用的LMWH，并且在抗凝机制上与传统肝素药物存在差异。

在实验过程中，研究团队首先验证了BfFKP对不同类型的岩藻糖基化底物的适应性。他们发现，BfFKP不仅能够催化未硫酸化的岩藻糖（Fuc）转化为GDP-岩藻糖（GDP-Fuc），还能识别并催化硫酸化岩藻糖（sFuc）生成GDP-硫酸化岩藻糖（GDP-sFuc）。这一发现为后续的岩藻糖基转移反应提供了重要的前体。随后，研究团队进一步优化了α1,3-岩藻糖基转移酶（Hpα1,3-FucT）的性能，通过截断其C端并引入四个关键突变（A128N、H129E、Y132I和S46F），构建出一种更具适应性的突变体（Hpα1,3-FucTM）。这种突变体能够有效识别并催化GDP-Fuc和GDP-sFuc作为供体，将岩藻糖基连接到硫酸软骨素A（CS_A）的特定位置，从而实现FCS多糖的高效合成。

在合成策略方面，研究团队采用了一种“一锅法”（one-pot multienzyme method）的多酶协同反应体系，使得整个合成过程更加简便和高效。通过这种方法，研究人员成功合成了四种不同结构的FCS多糖，并利用核磁共振（NMR）和质谱（MS）等技术对其结构进行了详细分析。结果显示，这些合成的FCS多糖在结构上与天然FCS高度相似，且具有较高的纯度和均一性。此外，通过NOESY实验进一步确认了不同硫酸化模式的岩藻糖基在FCS主链上的连接方式，揭示了其在结构上的精确性。

为了评估这些合成FCS多糖的抗凝活性，研究团队采用了多种体外检测方法，包括活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶时间（TT）等。实验结果表明，F2S4SCSA的抗凝活性显著高于其他类型的FCS多糖和LMWH。具体而言，F2S4SCSA仅需14.9 μg/mL的浓度即可将APTT延长至两倍，而LMWH则需要29.1 μg/mL。这一结果凸显了F2S4SCSA在抗凝效率上的优势，同时也说明了岩藻糖侧链的硫酸化模式对FCS抗凝活性的关键作用。进一步的实验发现，F2S4SCSA主要通过抑制内在凝血途径中的因子X酶复合物（FXase）发挥作用，而对其下游的凝血酶（FIIa）和因子Xa（FXa）几乎没有影响。这表明F2S4SCSA具有高度的选择性，能够精准靶向FXase复合物，从而降低出血风险。

此外，研究团队还通过表面等离子共振（SPR）技术深入探讨了FCS与FIXa之间的相互作用机制。SPR实验结果显示，不同结构的FCS与FIXa的结合能力存在显著差异，其中F2S4SCSA的结合常数（Kd）为1.05 × 10??，远低于其他类型的FCS多糖。这一结果进一步支持了FCS抗凝机制的核心观点：即其抗凝活性主要依赖于岩藻糖侧链上的负电荷硫酸基团与FIXa表面的正电荷精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）之间的特异性结合。为了验证这一假设，研究团队还对FIXa的精氨酸和赖氨酸进行了化学修饰，消除了其表面的正电荷。实验表明，去除精氨酸或赖氨酸后，FCS与FIXa的结合能力明显下降，而同时去除两者则导致结合能力显著降低。这进一步说明，FCS的抗凝效果是通过其岩藻糖基上的硫酸基与FIXa的正电荷位点之间的相互作用实现的，而这种相互作用是其发挥抗凝功能的关键。

从机制上看，FCS通过与FIXa结合，阻止其参与形成因子X酶复合物（FXase），从而抑制凝血过程中的关键步骤。这一机制与传统肝素的作用方式不同，后者主要通过抑制FXa和FIIa发挥作用，而FCS则更专注于抑制FXase的活性。这种选择性使得FCS在抗凝治疗中具有更低的出血风险，同时保持较高的抗凝效率。因此，F2S4SCSA被视为下一代抗凝药物开发的有力候选者。

在实际应用方面，FCS多糖的合成方法不仅提高了产物的纯度和产量，还为后续的药物开发和结构优化提供了坚实的基础。传统化学合成方法虽然能够实现FCS的结构控制，但其操作复杂、产率低，难以满足大规模生产的需求。相比之下，酶催化合成方法具有更高的效率和更低的成本，能够快速生成结构均一的FCS多糖。此外，这种方法还具备良好的可扩展性，为未来大规模制备FCS基抗凝药物提供了可行的路径。

从整体来看，本研究的创新点在于首次成功构建了一个能够高效合成具有特定硫酸化和岩藻糖基化模式的FCS多糖的酶催化体系。该体系不仅克服了天然FCS结构异质性带来的限制，还为理解FCS的抗凝机制提供了重要的实验依据。通过结构与功能的系统研究，研究人员揭示了FCS抗凝活性与岩藻糖基硫酸化模式之间的密切关系，并证明了这种结构在抗凝治疗中的优越性。未来，基于FCS的新型抗凝药物有望在临床应用中展现出更高的安全性和有效性，为治疗血栓相关疾病提供新的解决方案。