通过原位磷酸化激活和环闭合连接实现功能性RNA的高效组装

《Journal of the American Chemical Society》：Efficient Assembly of Functional RNA by in Situ Phosphate Activation and Loop-Closing Ligation

非酶促RNA组装策略研究：通过现场磷酸活化与环闭合连接高效合成功能性RNA分子。该研究首次报道N-甲基咪唑催化的磷咪唑啉中间体生成机制，在无高价金属离子条件下实现92%以上产率，成功组装突变型Flexizyme并保持催化活性。实验优化了pH（8.0）、催化剂浓度（25-200 mM）及反应时间（24-72小时）等关键参数，证实该策略兼容脂肪酸膜系统，为RNA世界假说提供了新证据。

　　本研究探讨了在没有高效RNA复制酶的情况下，RNA分子如何可能在早期生命起源中形成，并提出了一个基于原生化学条件的磷酸激活与环状连接反应的新策略。RNA世界假说认为，RNA不仅作为遗传物质，还承担了催化功能，这在现代生物中也得到了体现，如RNA病毒的遗传物质和核酶（ribozyme）的催化作用。此外，核糖体的肽基转移酶中心完全由RNA构成，这一特征被认为是连接RNA世界与现代生命的分子遗迹。从进化角度看，RNA催化功能可能逐渐被更高效的蛋白质酶所取代，导致核酶的减少和依赖RNA的原始生命形式的消失。然而，通过体外选择技术，人们可以发现具有催化功能的RNA结构，包括聚合酶核酶，这为在实验室条件下重建一个自我复制的RNA世界提供了可能性。尽管如此，一个基本问题仍未解决：在没有预存复制酶的情况下，第一个功能RNA分子是如何形成的？

RNA分子的组装通常涉及短寡核苷酸的连接，这一过程在无酶催化下通常通过非酶促连接反应完成。然而，形成磷酸二酯键连接短未激活的寡核苷酸形成更长的寡核苷酸，在水性环境中既存在热力学和动力学上的不利因素。为克服这一反应障碍，需要高能前体。在现代生物中，这通过酶促催化实现，例如ATP驱动的磷酸二酯键形成。相比之下，非酶促连接通常依赖于预先活化的5′-磷酸咪唑化寡核苷酸或带有2′,3′-环状磷酸的寡核苷酸。对于咪唑活化的寡核苷酸，高能P–N键有助于连接，因为咪唑是良好的离去基团。然而，这种高反应性也伴随着对水解的更高敏感性，从而限制了连接效率。为了提高效率，通常需要高浓度的二价金属离子，但这些离子也容易导致RNA降解，并可能破坏脂肪酸为基础的原始细胞膜结构。此外，实验室中合成磷酸咪唑化物通常需要化学活化和沉淀或高效液相色谱纯化，使得整个过程不连续且耗时，这在原始地球环境下的化学可能性较低。

有效的RNA连接需要3′–OH和活化的5′-磷酸的紧密接近和适当取向，这通常通过模板链实现。然而，模板链可能会抑制核酶的折叠，通过连接产物的紧密结合。为解决这一限制并提高连接效率，模板通常通过纯化步骤去除，或者通过设计优化的模板序列和/或替换3′-羟基为更亲核的氨基基团来实现。最近的研究发现，预活化的短双链结构在单链突出部分可以通过跨链反应进行环状连接，直接形成RNA发夹结构。这种过程利用了双链中相同末端的两个链之间的接近性。高通量筛选识别出一些突出序列（如UNNG、CNNG和GNNA）能够有效促进环状连接，这些序列在现存生物的四环结构中频繁出现。环状连接减少了模板对连接过程的抑制作用，但涉及多个环闭合的RNA组装仍存在内在活性限制和水解竞争，因此效率较低。

我们假设通过原位磷酸激活和环状连接化学反应，可以解决RNA组装的原始地球可行性问题和由于水解导致的低效率问题。甲基异氰化物（MeNC）被认为是一种潜在的原生磷酸激活剂，可以通过酸催化或涉及醛的Passerini型反应激活磷酸。我们设想动态自组装的短RNA结构可以通过咪唑拦截的Passerini反应进行激活，生成磷酸咪唑活化的寡核苷酸，随后进行环状连接，生成完整的功能RNA产物。在本研究中，我们探索了与原位磷酸激活和环状连接兼容的条件，采用甲基异氰化物、共活化醛和咪唑催化剂。在优化条件下，我们通过两次并发的环状连接反应，实现了Flexizyme的近定量组装。核磁共振（NMR）光谱识别出一种N-咪唑酰-N′-甲基咪唑??（IMI）物种，该物种激活磷酸，形成N-甲基-磷酸咪唑??中间体，随后进行金属独立的环状连接反应。我们的研究提供了关于原始地球环境下结构化、功能RNA自组装的机制性见解，并提出了在化学合成长RNA分子方面的可行策略。

在这一研究中，我们首先评估了关键成分对原位磷酸激活和环状连接的影响。为了模拟环状连接反应，我们使用了6个碱基对的双链作为起始材料。该双链由带有3′-UUCG突出的磷酸接受链（P1）和磷酸供体链（L1）组成。为了进行定量分析，磷酸接受链（P1）在其5′-端标记了BODIPY荧光探针。我们假设由MeNC和醛形成的瞬态腈化物可以被RNA的5′-磷酸攻击，生成5′-咪唑酰磷酸RNA，随后被咪唑拦截，形成活性的5′-磷酸咪唑??，从而促进连接。对于初始反应条件，我们使用了1 μM双链RNA、200 mM MeNC、200 mM乙醛、200 mM N-甲基咪唑和200 mM HEPES（pH 8），在18°C下孵育24小时。令人满意的是，变性凝胶电泳显示在24小时后环状连接产物的产率达到了88%。随后，我们系统评估了各种可能影响连接效率的因素，包括醛类型、催化剂类型、pH值、金属离子存在和试剂浓度。

在实验中，我们发现不同类型的醛对反应的影响显著。所有测试的原位环状连接反应都产生了预期的连接产物，但效率不同。产率从24小时后乙醛为88%到甘油醛为3%。乙醛的较高产率可能与其较低的立体障碍有关，这有助于与咪唑的反应。然而，其他醛如甘油醛的较低产率可能是由于其快速消耗导致的中间体的减少。此外，我们还测试了不同的咪唑催化剂，发现N-甲基咪唑和N-羟乙基咪唑的产率分别为88%和85%。然而，引入C-2位置的甲基团后，N-甲基咪唑的产率下降到41%，这可能是由于立体位阻影响了咪唑对咪唑酰磷酸中间体的攻击。相比之下，当使用其他咪唑（如Im4、2-氨基咪唑和4,5-二氰咪唑）作为催化剂时，未检测到连接产物。这表明，形成带正电荷的磷酸咪唑??中间体，而不是中性的磷酸咪唑化物，对于后续的环状连接至关重要。这些发现与之前观察到的N-甲基咪唑通过咪唑离去基团交换加速环状连接的结论一致。

此外，我们还研究了金属离子对反应的影响。虽然二价金属离子对于非酶促RNA引物延伸是必要的，但在这些反应中需要高浓度的金属离子，这可能与脂肪酸为基础的原始细胞膜结构不兼容。为了评估金属离子在原位磷酸激活和环状连接中的作用，我们测试了一系列金属盐，包括单价离子（LiCl、NaCl、KCl）和二价离子（CaCl2、MgCl2）。在中等浓度（100 mM单价离子和25 mM二价离子）下，未观察到连接产率的显著变化。然而，在高浓度（100 mM Mg2+或Ca2+）下，连接效率下降，这可能是由于反应中间体的水解增加。为了确定二价金属离子是否具有催化作用，我们从反应混合物中排除了这些离子，并添加了1 mM EDTA以螯合和隔离任何残留的二价金属离子。结果表明，二价金属离子对反应的影响较小，这与依赖预活化的磷酸咪唑化物的系统形成对比，后者需要高浓度的镁离子以实现高效的磷酸二酯键形成。

最后，我们研究了活化试剂浓度对连接效率的影响。从原始地球的角度来看，毫摩尔浓度的MeNC比模型原始化学反应中常用的高浓度（数百毫摩尔）更为合理。为了评估活化试剂浓度的影响，我们排除了HEPES缓冲液以消除其影响，并将N-甲基咪唑溶液调整为pH 8。这使我们能够在较低浓度的活化试剂下找到理想条件。将活化试剂的浓度从100 mM降低到25 mM，连接效率从65%提高到92%。然而，进一步降低到1 mM时，产率在24小时内仅为4%，且在3天后仅为11%。这表明，在较低浓度下，可能无法形成足够的腈化物，从而限制了磷酸活化，进而影响连接效率。通过优化这些条件，我们发现活化试剂的浓度可以低至3–10 mM。值得注意的是，一个原始地球环境中存储的MeNC，作为Fe(II)复合物（约20 mM），在紫外照射下可释放约3 mM的MeNC，为磷酸活化提供了可能的原始地球场景。

在本研究中，我们还探讨了原位激活条件下核苷酸修饰的可逆性。正如之前所述，RNA在我们的原位激活条件下可能经历化学修饰。已知尿嘧啶（U）和鸟苷（G）在pH 8下对碳二酰胺的易感性较高，这与其N3和N1位置的pKa值约为9.2有关。当这些核苷酸不参与碱基配对时，它们作为亲核试剂，在脱质子后可以攻击活化试剂。这一特性已被广泛用于RNA结构的探针研究。在我们的原位激活条件下，我们观察到RNA的严重修饰，并且这种修饰依赖于甲基异氰化物和醛的存在，而不是其他添加剂。为了确定修饰位点，我们使用了带有荧光标记的10个核苷酸寡核苷酸（A10、C10、U10和GA5），在pH 8、室温下与甲基异氰化物和2-甲基丁醛反应24小时。RNA凝胶电泳显示，A10和C10未出现明显修饰，而U10被严重修饰，GA5则表现出轻微修饰。这些结果表明，修饰位点不是RNA的内部2′-羟基，而是尿嘧啶和鸟苷的核苷酸，与RNA在碳二酰胺下的修饰一致。

为了进一步确认修饰的性质，我们对单个核苷酸单磷酸（A、U、G、C）进行了激活条件下的实验，并通过1H NMR和31P NMR进行了监测。尿嘧啶单磷酸在18小时后转化为新的物种，被确定为通过脱质子的N3对反应性腈化物的亲核攻击形成的N3-咪唑酰尿嘧啶。值得注意的是，N3-咪唑酰尿嘧啶在室温下于8天后热不稳定，回退为尿嘧啶，当加热至95°C时，这一过程加速至30分钟。而鸟苷单磷酸在相同条件下未发生显著变化，GA5的4%修饰在加热后降至1%。重要的是，通过加热处理，化学修饰的副产物可以转化为所需的连接产物，而不会发生显著降解。这些发现表明，在连续的非酶促原位激活条件下，RNA修饰是不可避免的，但可以通过优化反应条件和反应后水解来减少，这可能模拟原始地球上的波动环境。

我们还比较了原位激活与分步活化策略的效率。此前的RNA连接方法依赖于预先合成和纯化的5′-磷酸咪唑化物RNA，随后与含有突出的第二RNA链反应，以促进环状连接。这种过程需要高浓度的N-甲基咪唑和二价金属离子，但即使在最佳突出序列下，连接产率也难以超过65%。相比之下，我们开发的原位激活方法显著简化了流程。通过直接混合未活化的RNA底物、MeNC、醛和N-甲基咪唑，连接效率得到明显提高。为了比较这两种策略，我们对之前测试的环状连接构建物进行了原位激活条件下的实验。令人惊讶的是，对于UUCG和CAGG突出，产率达到了96%和81%，而分步活化方法的产率仅为69%和28%。这些发现强调了原位激活策略的优势，展示了其更高的连接效率和更简便的流程，这为RNA的合成提供了实用的途径。

在本研究中，我们进一步评估了通过多步原位环状连接反应组装功能RNA的效率。Flexizyme（dFx）作为一种体外进化的核酶，已被开发为RNA 3′-OH氨基酰化和基因密码重编程的有效工具。我们采用了一种突变的Flexizyme（dFx-mut）作为模型，以评估原位激活和环状连接的有效性。为了促进这一过程，dFx-mut被拆分为三个部分（F1、F2和F3）进行顺序连接。这些片段在pH 8、18°C下与MeNC、乙醛和N-甲基咪唑孵育。在2天后，观察到一个或两个环闭合的产物，产率分别为70%和18%。F1与F2之间的连接效率（88%）与F2与F3之间的连接效率（18%）形成鲜明对比。我们怀疑，这种低效率可能是由于在寡核苷酸合成过程中引入的 bulky 三乙基铵反离子，以及F3的自二聚竞争相互作用。添加100 mM NaCl显著提高了效率，产率达到了84%的完整产物F1–F2–F3，仅9%的部分产物F1–F2。虽然增加活化试剂浓度到100 mM并未提高产率，但将活化试剂的添加分为两批（分别在0小时和24小时添加），使得突变的Flexizyme三个短片段的高效组装达到了90%的产率。

此外，我们评估了原位组装的Flexizyme的催化活性，考虑到其环区中UUCG结构的引入和可能的化学修饰。作为对照，我们使用了两种参考核酶：dFx和dFx-mut，它们通过标准的3′-5′磷酸二酯键合成。dFx-mut在dFx活性的70%左右，确认了环区中UUCG结构的引入不会显著影响核酶功能。同样，原位组装的全长Flexizyme，无论是未经热处理（dFx-mut-a）还是经热处理（dFx-mut-a*）后，其活性与dFx-mut相当。dFx-mut-a*中的2′-5′磷酸二酯键并未影响Flexizyme的活性。这表明，dFx-mut-a的修饰程度较低。这些发现表明，UUCG环区突变、2′-5′磷酸二酯键和轻微的化学修饰对核酶功能没有显著影响。本研究确立了通过原位磷酸激活和多步环状连接反应高效组装功能RNA的可行性，为RNA合成提供了可扩展的策略。

通过本研究，我们发现了一种新的磷酸激活途径，涉及关键的N-咪唑酰-N′-甲基咪唑??（IMI）中间体。早期研究表明，咪唑通过亲核催化加速咪唑酯的水解。在这里，我们证明了咪唑通过IMI中间体促进磷酸的激活。这些IMI中间体类似于由azole稳定化的咪唑??盐，已被用于肽合成。我们的研究为开发兼容水性条件的活化试剂提供了一种新方法。类似地，亲核碱基，特别是尿嘧啶，在连续的原位激活过程中会发生修饰。然而，大多数修饰的基团可以通过水解逆转，而不会导致RNA降解。这种可逆的修饰可能是有益的，因为它会减缓互补RNA链在链分离和修饰后的重新配对。这反过来又有助于后续的模板导向复制和连接过程，因为未修饰的区域仍可被短寡核苷酸结合并参与反应。我们的研究突显了在长时间的潜在原始激活条件下保持RNA完整性的方法的稳健性。与分步活化和连接过程相比，原位方法简化了实验操作，同时实现了更高的产率。我们在此开发的近定量连接方法为非酶促合成长RNA提供了希望，为组装功能RNA分子提供了一种可扩展且高效的方法。