将一种依赖血红素的脱水酶转化为哌嗪酸合成酶，揭示了血红素丙酸基团在N-N键形成中的作用

《Journal of the American Chemical Society》：Conversion of a Heme-Dependent Dehydratase to a Piperazate Synthase Reveals the Role of the Heme Propionate Group in N–N Bond-Formation

NohD酶与PipS酶在催化N–N键形成中存在关键结构差异，通过解析NohD晶体结构及突变体实验，发现heme propionate的取向改变调控氮氢键断裂与重组，揭示酶活性位点中Thr/Lys二联体和heme propionate的协同作用机制。

　　在自然界中，氮-氮（N–N）键的形成是多种生物化学过程中的关键环节，例如氮循环、生物合成以及一些重要的代谢反应。这种类型的化学键不仅存在于简单的分子如氮气（N?）和一氧化二氮（N?O）中，也出现在诸如火箭燃料肼（N?H?）和许多具有药理活性的化合物中。在天然产物的生物合成过程中，含有氮-氮键的化合物尤其受到关注，因为它们往往具有重要的生物活性，包括免疫抑制、抗真菌、抗HIV等。其中，含有哌嗪酸（piperazic acid）结构的肽类化合物，是自然界中最为常见的氮-氮键含有的天然产物之一，已有数百种被报道。

哌嗪酸的合成通常涉及一个两步过程：第一步是通过类似KtzI的黄素依赖性单加氧酶，将L-鸟氨酸转化为L-N5-OH-鸟氨酸；第二步则由类似KtzT和PipS的血红素依赖性哌嗪酸合成酶催化，完成环化反应形成L-哌嗪酸。在此过程中，血红素辅因子起着至关重要的作用，它不仅为反应提供了一个合适的金属中心，还可能通过其特定的构型影响底物的反应路径。此前，我们已经解析了PipS的晶体结构，发现其可能通过一个类似氮烯（nitrenoid）的中间体进行氮-氮键的形成。然而，尽管这一机制已被提出，关于N–N键形成的具体结构基础仍存在许多未解之谜。

在本研究中，我们发现了一种与PipS序列相似的酶NohD，它虽然可以与L-N5-OH-鸟氨酸反应，但其主要产物是氨（ammonia）而非哌嗪酸。通过解析NohD的晶体结构，我们确定了其活性位点中的关键残基，并利用结构指导的定点诱变技术，成功改造了NohD的活性，使其具备哌嗪酸合成酶的活性。进一步的晶体结构分析揭示了血红素的丙酸侧链在酶活性中的重要作用，其构型变化使得丙酸侧链能够向上靠近氨基氮，从而可能激活氨基，为N–N键的形成提供条件。这一研究不仅揭示了N–N键形成的关键结构要求，也为开发新的N–N键形成催化剂奠定了基础。

NohD的发现源于我们对哌嗪酸衍生非核糖体肽—— Luzopeptins的生物合成路径的探索。我们发现其产生菌株Actinomadura luzonensis DSM 43766的基因组中存在两个可能的哌嗪酸合成酶基因，即orf04019和orf04899。之前的研究表明，orf04019的失活会导致Luzopeptins的合成受阻，从而证明了该基因编码的酶Luz13在哌嗪酸合成中的关键作用。然而，orf04899在基因互补实验中未能有效恢复Δluz13突变株的活性，且其基因簇中缺乏L-N5-羟化酶基因，进一步排除了其作为哌嗪酸合成酶的可能性。尽管如此，NohD与哌嗪酸合成酶在序列上高度相似，并且含有两个关键的催化残基（Thr98和Lys167），这表明它可能仍能接受哌嗪酸合成酶的底物L-N5-OH-鸟氨酸。此外，我们还发现，哌嗪酸合成酶在非天然底物（如N-苯基羟胺）上的脱水活性，使得我们对NohD是否也能对这些底物产生反应产生了兴趣。

为了验证这一假设，我们纯化了His?标记的NohD蛋白，并观察到其能够结合血红素b，具有与PipS相似的Soret吸收峰（406 nm）。我们随后将NohD与L-N5-OH-鸟氨酸或N-苯基羟胺反应，并通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）分析反应产物。结果显示，NohD能够对两种底物进行脱水反应，释放出氨，这使得我们将其命名为NohD（N–OH脱水酶）。然而，即使在体外实验中，NohD对L-N5-OH-鸟氨酸的反应也仅产生极少量的哌嗪酸，这表明其天然功能可能并非N–N键的形成，但其与PipS的序列相似性以及催化残基的共存，使其成为研究N–N键形成结构基础的理想对象。

通过解析NohD的高分辨率晶体结构（1.4 ?），我们发现其整体折叠结构与PipS非常相似，RMSD仅为1.62 ?（基于1026个原子）。NohD同样含有血红素b辅因子，其中H57作为轴向配体。然而，NohD与PipS之间仍存在一些关键差异。首先，在PipS中，His?标签能够结合到血红素铁的远端位点，而在NohD中，我们观察到电子密度与水分子结合，而非His?标签。此外，NohD的C端距离活性位点较远，这使得His?标签无法与血红素铁直接结合。其次，NohD的活性位点中包含一些PipS中没有的残基，例如R144和D171，这些残基可能在催化过程中起到重要作用。我们之前的研究表明，PipS中Y155F和E182A突变会显著降低其活性，而NohD中R144和D171的缺失并未影响其脱水活性，这说明这些残基可能并非N–N键形成的关键因素。

在PipS中，α-氨基氮通过与血红素丙酸的氢键作用被锚定在活性位点中，为N–N键的形成做好准备。然而，在NohD中，由于丙酸的构型被拉伸，远离活性位点，因此无法与α-氨基氮形成氢键，导致其在反应过程中缺乏对N–N键形成的促进作用。这种构型差异可能是NohD无法形成N–N键的重要原因。通过进一步的实验，我们发现NohD的活性位点中存在多个关键的结构差异，例如NohD的N端含有MHVFPR序列，而PipS则为MFVPSY。这些差异可能影响了底物的结合方式，从而改变了催化路径。

为了进一步探索NohD的结构与功能之间的关系，我们通过定点诱变技术对NohD进行了多个突变，包括对血红素丙酸侧链（HP1和HP2）以及活性位点（AS1和AS2）的改造。其中，HP1包括N端的6个残基，而HP2则涉及A59。我们发现，这些突变并未完全改变丙酸的构型，但部分突变确实使丙酸侧链向上靠近活性位点，类似于PipS中的情况。然而，由于突变后的NohD仍然无法形成N–N键，我们进一步对活性位点中的残基进行了改造，例如将V96替换为A96（AS2突变）。这一突变使得NohD能够产生少量的哌嗪酸，表明AS2突变可能在促进N–N键形成中起着重要作用。

为了进一步验证这些突变的作用，我们对NohD-HP1/HP2/AS1/AS2进行了结构解析，发现其丙酸侧链确实被翻转到活性位点，与PipS的结构相似。然而，丙酸侧链的两个氧原子的结合方式仍存在细微差异，这可能影响了底物的定位和反应路径。通过进一步的突变，我们引入了AS3（N端的171–176位残基）并将其替换为PipS的对应残基，使得NohD-HP1/HP2/AS1/AS2/AS3的哌嗪酸产量显著提高，同时氨的产量也有所变化。这一结果表明，NohD的结构和功能可以通过特定的氨基酸替换进行调整，从而使其具备N–N键形成的能力。

我们还对PipS进行了类似的突变实验，以探索其是否能够表现出NohD的脱水活性。例如，将PipS的A105替换为V96（AS2突变）和将N端的F2、P4、S5、Y6替换为H6、F6、P6、R6（HP1突变）。这些突变使得PipS的脱水活性显著提高，同时哌嗪酸的产量大幅下降。这表明，不同的氨基酸替换可能在不同的催化路径中起到不同的作用。通过进一步的结构解析，我们发现这些突变后的PipS结构与NohD的结构存在相似之处，例如丙酸侧链的翻转和活性位点中关键残基的替换。这些结构变化不仅影响了底物的结合方式，还可能改变了催化过程中的关键步骤，如氮的激活和氨基的定位。

总的来说，本研究揭示了N–N键形成的关键结构因素，包括血红素丙酸侧链的构型变化和活性位点中特定残基的替换。这些发现不仅有助于我们理解哌嗪酸合成酶的催化机制，也为开发新的N–N键形成催化剂提供了重要的结构信息。此外，研究还表明，即使是高度相似的酶，其催化功能也可能因结构上的微小差异而发生改变，这为生物催化研究提供了新的视角。未来，这些结构信息可以被用于设计具有更高催化效率的酶，从而在生物合成和药物开发等领域发挥更大的作用。