揭示具有细胞通透性的μMax调节因子的化学工程机制

《Journal of the American Chemical Society》：Chemical Engineering of Transcription Factors Uncovered Cell-Permeable μMax Modulators

分子设计与合成工程成功开发了新型Max转录因子变体μMax20及其衍生物，通过引入Lys31和Lys57的hArg突变及芳香嵌段修饰，显著增强了DNA结合活性（KD=4.38nM）和细胞渗透性（低至0.25μM即可实现高效核定位），有效抑制Myc致癌基因表达并阻断癌细胞增殖。

　　本研究聚焦于通过化学合成与结构设计相结合的方式，开发出具有增强稳定性和细胞渗透性的新型非天然转录因子（transcription factors, TFs）模拟物。转录因子在调控生命活动过程中扮演着至关重要的角色，尤其是在基因表达调控、细胞增殖、分化及凋亡等关键生理过程中。传统的转录因子研究多依赖于天然序列和结构，然而，这些天然结构在功能扩展方面存在明显限制。因此，科学家们开始探索通过引入非天然氨基酸和结构修饰来增强转录因子的活性和应用潜力。本研究通过结合理性设计与全合成策略，成功构建了多种基于Max蛋白的新型模拟物，并进一步通过特定位置的结构修饰，实现了对DNA结合能力与细胞渗透性的优化，为设计具有生物活性的新型转录因子模拟物提供了新的思路。

转录因子的结构复杂性使其在功能研究和生物医学应用中面临诸多挑战。尽管已有多种人工合成的转录因子模拟物被开发出来，如锌指蛋白等，但这些分子在细胞内的递送仍然存在困难。这不仅限制了它们的生物利用度，也影响了其在细胞内的功能表现。为了解决这一问题，研究团队提出了一种全新的策略，即通过化学合成的方法，对天然转录因子进行精确的结构修饰，从而在不破坏其核心功能的前提下，提升其生物活性和细胞渗透性。这种策略的核心在于利用固相肽合成（SPPS）和天然化学连接（NCL）等化学合成技术，实现对蛋白质关键位点的精准改造。

研究团队选择Max蛋白作为目标，因其在Myc-Max-Mad网络中具有重要作用。该网络通过形成二聚体与DNA上的增强子盒（E-box）序列相互作用，调控基因表达。通过分析Max蛋白的晶体结构和序列信息，研究者确定了六个关键残基，这些残基与E-box序列的碱基配对或磷酸骨架相互作用，从而影响其DNA结合能力。基于此，研究团队设计了一系列非天然氨基酸替换方案，旨在优化这些关键残基的电子特性与空间结构，以增强其与DNA的相互作用。例如，将赖氨酸（Lys）替换为含额外甲基的同源精氨酸（hArg），或将组氨酸（His）替换为具有类似结构的噻唑烷基丙氨酸（Tha），从而提升其与DNA的结合能力。

在合成策略上，研究团队首先将Max蛋白的DNA结合结构域分为两个肽段，分别进行固相肽合成，并通过NCL技术将二者连接起来。这一过程允许研究者在多个关键位点引入非天然氨基酸或结构修饰，从而构建出一系列具有不同功能特性的模拟物。合成后的模拟物被进一步筛选和验证，以评估其DNA结合能力、细胞渗透性以及对Myc驱动基因表达的抑制效果。其中，研究团队特别关注了两种主要的模拟物：μMax20和其含芳香支架的变体。μMax20模拟物包含两个关键突变（Lys31和Lys57替换为hArg），这些突变显著提升了其DNA结合能力，并在较低浓度下表现出良好的细胞渗透性。

为了进一步提升μMax20模拟物的稳定性与细胞渗透性，研究团队引入了芳香支架（aromatic staples）结构。这种结构修饰通过增强蛋白质的构象稳定性，使其在细胞内能够更有效地与DNA结合并发挥作用。实验结果表明，含芳香支架的μMax20模拟物在纳米摩尔浓度下即可实现高效的细胞渗透，并在细胞核内形成明显的荧光信号。这表明这些模拟物不仅能够进入细胞，还能在细胞核内保持其结构完整性，从而有效干扰Myc驱动的基因表达。

通过荧光显微镜观察，研究团队发现这些模拟物在不同浓度下的细胞渗透行为存在显著差异。其中，含有双芳香支架的μMax20模拟物在250纳摩尔浓度下即可实现有效的细胞内化，并在更高浓度下显示出更强的核定位能力。这种现象可能与模拟物的结构稳定性以及其与细胞膜的相互作用有关。值得注意的是，这些模拟物的细胞内化过程涉及两种机制：一种是通过内吞作用（endocytosis）进入细胞，另一种则是通过直接跨膜渗透（direct membrane translocation）进入细胞核。这种双重机制的发现，为理解这些模拟物如何在细胞内发挥功能提供了新的视角。

在功能评估方面，研究团队利用荧光素酶报告系统，验证了μMax20模拟物对Myc驱动基因表达的抑制能力。实验结果显示，μMax20及其含芳香支架的变体在低浓度下即可显著抑制Myc的转录活性，其中双芳香支架修饰的μMax20表现出最强的抑制效果。此外，研究团队还评估了这些模拟物对癌细胞增殖的影响。结果显示，μMax20模拟物在16微摩尔浓度下显著抑制了HeLa细胞的增殖，且其中双芳香支架修饰的版本表现出更优的抗增殖活性。这一结果进一步表明，这些模拟物不仅具有良好的细胞渗透性，还能够有效干扰Myc相关的细胞功能，从而在抗癌研究中展现出应用潜力。

研究团队还通过蛋白结合微阵列（PBM）实验，评估了μMax20模拟物的DNA结合特异性。结果显示，尽管μMax20模拟物在某些关键位点进行了突变，但其对E-box序列的结合偏好与天然Max蛋白保持高度一致。这一发现表明，突变并未破坏其核心的DNA识别能力，反而可能通过优化残基的电子特性，提升了其与DNA的相互作用强度。此外，研究团队还通过生物层干涉技术（BLI）测定了μMax20模拟物与E-box序列的结合亲和力，发现其结合常数（Kd）显著优于天然Max蛋白，进一步验证了其在DNA结合方面的优越性。

除了DNA结合能力，研究团队还关注了这些模拟物在细胞内的稳定性和毒性。通过体外蛋白酶降解实验，发现含芳香支架的μMax20模拟物在细胞内表现出更强的稳定性，其半衰期约为天然Max蛋白的2.5倍。这表明这些模拟物在细胞内具有更长的停留时间，从而可能更有效地发挥其生物功能。同时，通过荧光显微镜观察，研究团队发现这些模拟物对细胞形态和结构没有明显影响，表明其具有较低的细胞毒性。

综合来看，本研究通过化学合成与结构设计相结合的方法，成功构建了一系列具有增强功能特性的非天然转录因子模拟物。这些模拟物不仅在DNA结合能力上优于天然蛋白，还表现出良好的细胞渗透性与稳定性，使其在生物医学研究中具有广阔的应用前景。此外，研究团队还发现，通过引入芳香支架等结构修饰，可以进一步提升模拟物的功能活性，为设计新型生物活性分子提供了新的思路。未来，这些模拟物有望用于抗癌药物开发、基因调控研究以及细胞内信号传导调控等领域，为生命科学和医学领域带来新的突破。