将反应性量子力学分子动力学模拟与诱变技术、晶体学及酶动力学相结合，揭示异氰酸酯水解酶催化作用的合理步骤

《Journal of Chemical Information and Modeling》：Combining Reactive Quantum-Mechanical Molecular-Dynamics Simulations with Mutagenesis, Crystallography, and Enzyme Kinetics to Reveal Plausible Steps of Isocyanide Hydratase Catalysis

中间体形成机制及Asp17的关键作用研究。

　　酶的催化机制研究是理解生物学和生物化学中复杂反应过程的关键。为了更深入地揭示酶的反应机制，需要了解化学反应中每个步骤的原子级细节。然而，目前的实验方法在获取这些细节方面存在局限性，尽管近年来X射线自由电子激光（XFEL）和同步辐射技术的出现显著提升了时间分辨结构研究的能力，使得对酶中间体的原子结构有了更清晰的了解。这些研究在某些情况下可以提供酶催化反应所需的原子级信息，但仍然难以全面覆盖所有细节。

在这一背景下，经典分子动力学（MD）模拟可以提供酶结构和动态的详细信息，而加入量子力学（QM）电子结构计算则能够模拟和表征化学反应，揭示更深层次的反应机制。例如，混合量子力学/分子力学（QM/MM）方法已被广泛用于评估酶催化机制中可能的替代路径。然而，这类方法通常受限于小的量子区域或较短的时间尺度，导致计算成本较高。随着量子力学分子动力学（QMD）技术的发展，特别是基于扩展拉格朗日玻恩-奥本海默分子动力学（XL-BOMD）方法的出现，研究者可以实现更高效、更精确的模拟。

XL-BOMD方法通过使用一个近似但精确的“影子”玻恩-奥本海默势能，将计算成本显著降低，同时保持较高的准确性。这种方法的核心在于利用精确的原子间力计算，结合一个近似优化后的能量泛函，从而实现稳定的QMD模拟。尽管原始的XL-BOMD方法在非反应系统中表现出色，但在涉及反应的系统中需要进行复杂的迭代自洽电荷计算，这会显著增加计算时间。而最新版本的XL-BOMD方法能够在能量间隙较小的情况下避免这种迭代优化，从而实现对高度反应性系统的高效模拟。

本文中，我们使用最新的XL-BOMD方法开发了一种“反应性QMD”流程，并将其应用于研究酶催化反应的分子机制。所选择的酶模型是异氰化物水合酶（ICH），该酶催化异氰化物转化为N-甲酰胺的过程，通过酶连接的硫代氨基甲酸中间体完成。ICH反应在假单胞菌中具有重要的防御作用，与抗生素耐药性有关。ICH是一个理想的模型系统，用于研究QMD方法在酶机制中的应用，因为它结合了共价和酸碱催化策略，并且已经被广泛表征。

为了研究ICH反应的详细机制，我们首先关注反应的初始步骤：从对硝基苯基异氰化物（p-NPIC）形成硫代氨基甲酸中间体。我们模拟了p-NPIC与ICH活性位点残基的分子模拟物之间的反应，分析了它们的构型和电荷动态变化。这些模拟显示，p-NPIC的异氰化碳原子在硫代氨基甲酸形成之前经历了一次质子化，这可能表明Asp17在ICH催化反应的早期阶段扮演了质子供体的角色。为了验证这一机制，我们对野生型和D17N突变体ICH进行了X射线晶体学和预稳态酶动力学研究。结果表明，结构和动力学对D17N突变表现出显著的变化，与模拟中观察到的反应步骤顺序一致。

移动的质子在许多酶中发挥着关键作用，但它们在实验中难以直接观测，使得质子依赖步骤的顺序变得模糊。QMD模拟能够直接提供关于酶机制中质子运动的信息，这对于理解ICH反应机制具有重要意义，并为其他酶的类似研究提供了新的思路。我们的研究结果为ICH的催化机制提供了新的视角，表明Asp17在反应的早期阶段可能作为质子供体，而在后期则可能作为质子接受体，促进水分子对硫代氨基甲酸中间体的攻击。

在QMD模拟中，我们使用了新的参数设置，包括硫（S）元素，以模拟ICH催化反应所需的反应性化学。这些参数通过与高精度密度泛函理论（DFT）计算结果的对比进行了验证，显示了其在模拟硫代氨基甲酸形成中的适用性。此外，我们还对模拟中的电子密度变化进行了分析，发现异氰化碳原子在质子化后，其电子密度的分布发生了显著变化，这可能增强了硫醇基硫原子对异氰化碳的亲核攻击。

通过结合X射线晶体学和酶动力学实验，我们进一步验证了QMD模拟中提出的机制。D17N突变体ICH的结构和动力学数据表明，Asp17在反应中的重要性，尤其是在中间体的形成和水解过程中。同时，我们还发现Asp17的质子化状态在不同pH条件下发生了变化，这可能影响其作为质子供体或接受体的能力。这些结果不仅支持了QMD模拟中提出的反应顺序，也为理解ICH催化机制提供了新的线索。

我们的研究还表明，反应性QMD方法在设计实验方面具有重要价值。通过分析模拟中的电子密度和电荷动态，我们可以预测可能的反应路径，并为实验设计提供指导。此外，我们还对其他DJ-1超家族蛋白的催化机制进行了讨论，指出这些蛋白虽然共享类似的活性位点结构，但它们的催化活性可能受到不同结构因素的影响。ICH与其他DJ-1蛋白的区别在于，ICH活性位点附近的Asp而非Glu可能更有利于其催化活性。

在实验设计中，我们使用了多种技术，包括蛋白质纯化、晶体生长、X射线数据收集和动力学分析。通过这些实验，我们验证了QMD模拟中提出的机制，并获得了关于ICH催化反应的进一步理解。此外，我们还对QMD模拟方法的计算效率进行了评估，发现其在大规模系统中具有显著的优势。这些结果不仅支持了反应性QMD方法的有效性，也为其他酶的类似研究提供了基础。

总的来说，本研究展示了反应性QMD方法在揭示酶催化机制中的潜力。通过结合高精度的电子结构计算和实验验证，我们能够更全面地理解异氰化物水合酶的催化过程。这种方法不仅适用于ICH，还可以推广到其他酶的催化机制研究中，为生物学和生物化学领域提供了新的工具和思路。