单细胞分析揭示HPV感染早期宫颈鳞癌中PI3+S100A7+角质形成细胞的作用及肿瘤微环境重塑机制

《Chinese Medical Journal》：Single-cell analysis identifies PI3+S100A7+keratinocytes in early cervical squamous cell carcinoma with HPV infection

本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，深入解析了早期宫颈鳞状细胞癌（CESC）在HPV感染背景下的肿瘤微环境（TME）细胞异质性。研究发现PI3+S100A7+增殖性角质形成细胞在HPV阳性肿瘤中特异性富集，并与CD163+巨噬细胞通过肿瘤坏死因子（TNF）、CCL2-CCR2等信号通路发生密切互作，共同促进炎症反应及免疫抑制微环境形成。该研究为理解HPV介导的宫颈癌恶性转化机制提供了新的视角。

　　

引言

宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤，其中宫颈鳞状细胞癌（Cervical Squamous Cell Carcinoma, CESC）是最主要的病理亚型，其发生发展与高危型人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）感染密切相关。HPV通过其早期基因E6和E7癌蛋白分别降解p53和视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），破坏宿主细胞的正常分化与增殖调控，最终导致恶性转化。然而，HPV感染本身并不足以完全解释肿瘤的异质性及进展过程。肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中的细胞成分，包括角质形成细胞、成纤维细胞、免疫细胞等，以及它们之间的复杂相互作用，在宫颈癌的发生发展中扮演着关键角色。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术能够以单细胞分辨率解析TME的细胞组成和基因表达谱，为深入理解HPV驱动的癌变过程提供了强大工具。

单细胞转录组图谱揭示CESC肿瘤与癌旁组织的细胞异质性

本研究对4例早期CESC患者（FIGO分期为IB1-IIA1）的肿瘤组织及其配对的癌旁组织进行了scRNA-seq分析。经过质控过滤后，共获得77,061个高质量细胞，其中肿瘤组织来源细胞34,038个，癌旁组织来源细胞43,023个。通过无监督聚类和经典细胞标志物表达分析，共鉴定出20个细胞亚群，包括成纤维细胞、多种角质形成细胞亚型（基底角质形成细胞、分化中角质形成细胞、增殖性角质形成细胞、表层角质形成细胞）、宫颈上皮细胞、鳞状上皮细胞、T细胞（细胞毒性CD8⁺ T细胞、初始CD4⁺ T细胞、调节性T细胞）、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、内皮细胞、间充质干细胞等多种细胞类型。所有细胞类型在肿瘤和癌旁组织中均有分布，但其比例存在显著差异。

比较分析发现，角质形成细胞和成纤维细胞是肿瘤组织与癌旁组织之间比例差异最显著的两类细胞。具体而言，增殖性角质形成细胞在肿瘤组织中显著富集，而基底角质形成细胞和表层角质形成细胞则主要存在于癌旁组织中，提示肿瘤组织中角质形成细胞的正常分化程序被破坏，增殖活性异常增强。相反，成纤维细胞在肿瘤组织中的比例显著低于癌旁组织，表明TME中基质成分发生了重塑。

通路富集分析显示，所有角质形成细胞亚型均显著富集于干扰素γ和干扰素α应答通路，反映了其在抗病毒和炎症信号中的作用。而成纤维细胞则独特地富集于上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）、血管生成和KRAS信号通路，凸显了其在细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）重塑、促血管生成和致癌信号传导中的活跃角色。

HPV驱动的角质形成细胞亚群转录与细胞动力学

在4例患者中，1例为HPV阴性，3例为HPV阳性（其中2例为高危型HPV16感染）。scRNA-seq数据分析显示，HPV16的早期基因（E1, E2, E5, E6, E7）和晚期基因（L1, L2）在HPV阳性患者的角质形成细胞中活跃表达，而在HPV阴性样本中未见表达。E6和E7基因的表达主要定位于分化中角质形成细胞，这与HPV破坏正常分化通路的机制相符。

差异表达基因分析揭示了增殖性角质形成细胞和分化中角质形成细胞之间显著的转录组差异。在增殖性角质形成细胞中，S100A7、PI3、SPRR3、CNFN等基因显著上调。基因集富集分析表明，增殖性角质形成细胞中TNF信号通路、干扰素α/β信号通路以及抗菌肽通路显著激活，而Slits and Robos通路则下调，提示细胞通讯和组织结构完整性受损。

特别值得注意的是，PI3（弹性蛋白酶特异性抑制剂）和S100A7（Psoriasin）在增殖性角质形成细胞中共同高表达，定义了一个独特的PI3⁺S100A7⁺角质形成细胞亚群。利用TCGA-CESC数据库进行验证发现，该亚群在肿瘤组织中的浸润水平显著高于癌旁正常组织，且其高浸润与患者不良预后显著相关。多重免疫荧光（multiplex Immunofluorescence, mIHC）实验进一步证实了PI3和S100A7蛋白在肿瘤组织角质形成细胞中的共表达及其富集现象。

转录因子活性分析显示，在HPV阳性样本中，SOX2是最活跃的转录因子，这与SOX2在宫颈癌进展中的已知作用一致。而在HPV阴性样本中，则主要由BARX1、HOXB13等转录因子调控，表明HPV感染状态驱动了截然不同的转录程序。

PI3⁺S100A7⁺角质形成细胞的存在导致CESC患者预后不良

为了探究HPV感染对角质形成细胞分化的影响，研究者利用Monocle 2软件构建了角质形成细胞的伪时间轨迹。轨迹分析显示，角质形成细胞的分化始于基底角质形成细胞，经历分化中状态，最终到达表层角质形成细胞。然而，增殖性角质形成细胞表现出复杂的轨迹，与正常分化路径存在偏离，提示其增殖活性增强可能为HPV复制提供了支持。沿伪时间轨迹，与增殖相关的通路如PI3K-Akt和Wnt信号通路在增殖性角质形成细胞阶段被激活。

通过CIBERSORTx算法对TCGA批量RNA-seq数据进行分析，再次确认PI3⁺S100A7⁺角质形成细胞亚群在肿瘤组织中富集，且其高浸润与患者较短的总生存期相关。mIHC分析不仅验证了该亚群在肿瘤中的富集，还揭示了其与CD163⁺巨噬细胞在空间上非常接近，暗示两者之间存在潜在的相互作用。

肿瘤相关巨噬细胞调控CESC的TME塑造

巨噬细胞在肿瘤组织中的比例高于癌旁组织。细胞间通讯分析发现，在肿瘤微环境中，免疫细胞间的相互作用总体减弱，但巨噬细胞成为相互作用最活跃的免疫细胞类型之一。受体-配体对分析揭示了巨噬细胞通过CD74分子参与的多条信号通路，如CD74-MIF（巨噬细胞迁移抑制因子）、CD74-COPA、CD74-APP等，其中MIF-CD74信号轴在巨噬细胞中高度活跃，该通路已知可激活ERK、PI3K/AKT等下游信号，促进肿瘤细胞存活和免疫逃逸。

特别值得注意的是，在HPV阳性肿瘤组织中，巨噬细胞与增殖性角质形成细胞（尤其是PI3⁺S100A7⁺亚群）之间的相互作用强度最高。这种相互作用主要由TNF、CCL2-CCR2、CXCL8、IL10等信号分子介导。生存分析显示，同时具有高浸润PI3⁺S100A7⁺角质形成细胞和高浸润CD163⁺巨噬细胞的患者，其总生存期最短。通路分析表明，这些细胞间的相互作用高度富集于细胞因子受体相互作用、核因子κB（Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB）信号通路和TNF信号通路，这些通路共同促进了TME中的分化、结构形成及炎症反应。

基于scRNA-seq数据的成纤维细胞和角质形成细胞表征

成纤维细胞是CESC TME中数量最丰富的细胞类型之一，但其在肿瘤组织中的比例低于癌旁组织，提示肿瘤进展中基质发生了动态变化。对成纤维细胞进行重新聚类和恶性程度评分后发现，表达癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblast, CAF）标志物（如ACTA2/α-SMA、POSTN）的成纤维细胞主要富集于肿瘤组织。进一步将成纤维细胞划分为4个亚型，其中C1亚型富含CAF，主要存在于肿瘤组织；而C3亚型则由未分化的成纤维细胞构成，主要存在于癌旁组织。基因集富集分析显示，CAF中"局部急性炎症反应涉及的细胞和分子"通路显著激活，强调了成纤维细胞通过介导炎症反应在宫颈癌进展中的作用。

HPV16与HPV66相关TME的独特细胞和分子特征

比较HPV16和HPV66感染肿瘤组织的细胞组成，发现二者存在明显差异。HPV16感染组织中，增殖性角质形成细胞和细胞毒性CD8⁺ T细胞更丰富；而HPV66感染组织中，成纤维细胞和鳞状上皮细胞比例更高。在分子水平上，HPV16感染组织的增殖性角质形成细胞高表达KLK5、WFDC2等基因，并富集于IL-17信号通路、TNF信号通路和HPV感染通路。其细胞毒性CD8⁺ T细胞高表达GZMB、GZMA、PRF1等细胞毒性分子以及免疫检查点分子CTLA4。HPV66感染组织的成纤维细胞高表达CCN5、APOE等与ECM重塑和脂代谢相关的基因，鳞状上皮细胞则高表达KRT13、CXCL14等与上皮分化和免疫调节相关的基因。这些发现强调了不同HPV亚型可能通过驱动独特的分子和细胞程序来影响TME，从而具有不同的致瘤机制。

讨论

本研究利用scRNA-seq技术深入刻画了早期CESC在HPV感染背景下TME的细胞景观和分子特征。核心发现是鉴定了一个与HPV阳性早期CESC相关的PI3⁺S100A7⁺增殖性角质形成细胞亚群。该亚群在肿瘤中富集，与不良预后相关，并与CD163⁺巨噬细胞在空间上邻近且功能上相互作用，通过TNF、CCL2-CCR2、CXCL8、IL10以及MIF-CD74等信号通路共同塑造了一个促炎、免疫抑制的TME，进而促进肿瘤进展。此外，研究还揭示了CAF在TME炎症反应中的重要作用，以及不同HPV亚型（HPV16 vs. HPV66）所对应的独特TME特征。

这些发现增进了对HPV介导的宫颈癌恶性转化早期事件的理解，揭示了角质形成细胞、巨噬细胞和成纤维细胞之间复杂的相互作用网络。PI3和S100A7作为潜在的预后生物标志物和治疗靶点值得进一步研究。未来研究可通过功能实验验证这些相互作用的分子机制，并探索靶向该互作网络的治疗策略。本研究也存在一些局限性，如样本量较小、缺乏功能性验证实验等，未来可结合空间转录组学等多组学技术进行更深入的探索。