通过基于呋喃的蛋白质生物素化技术对细胞表面组进行谱分析

《Journal of Proteome Research》：Profiling the Cellular Surfaceome by Furan-Based Protein Biotinylation

细胞表面组分析面临膜蛋白疏水性强、低丰度导致的质谱检测困难。本研究设计合成六种furan-biotin探针（FB1-FB6），发现FB1经氧化触发后特异性结合细胞表面蛋白，减少胞内蛋白干扰，且表面蛋白丰度高于传统NHS-生物素法。通过LC-MS/MS分析MCF-7和MCF-10A细胞表面组，发现FB1能更好区分两者差异，如MCF-7表面蛋白富含生长因子受体（EGFR、FGFR2、IGF1R）和细胞外基质蛋白，而MCF-10A则偏向黏附相关蛋白（CDH、Integrin）。该方法为表面组学研究提供高特异性解决方案。

　　细胞表面蛋白组在维持细胞稳态和细胞间通讯中起着至关重要的作用。这些蛋白不仅作为受体、转运蛋白和酶，还参与细胞黏附、信号传导以及病原体识别等关键过程。由于膜蛋白的疏水性质和低丰度，它们在基于质谱的蛋白组学研究中常常被低估。为了解决这一问题，本研究提出了一种利用呋喃化学的新方法，用于细胞表面蛋白组的分析。通过合成六种呋喃-生物素化合物（FB1-FB6），并验证其与赖氨酸和半胱氨酸的反应能力，我们发现当呋喃被氧化激活后，FB1在细胞表面蛋白标记方面表现出最高的染色强度和特异性。进一步的生物素化蛋白拉下实验表明，FB1在富集细胞表面蛋白方面比使用N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）生物素的方法更高效，并且能够减少对细胞内蛋白的非特异性标记。

细胞表面蛋白组的研究对于理解细胞功能和开发新药具有重要意义。许多药物靶点都位于细胞膜上，因为这些蛋白更容易被外界环境接触和修饰。例如，超过60%的临床药物都是针对膜蛋白的，这表明表面蛋白在药物开发中的重要性。此外，识别特定的表面标志物对于疫苗研发至关重要，因为这些标志物是宿主与病原体相互作用的关键。最近，针对细胞表面蛋白的单克隆抗体在癌症、自身免疫疾病等治疗中表现出更高的价值和特异性。然而，由于膜蛋白的复杂性和低丰度，对细胞表面蛋白组的全面分析仍然面临挑战。膜蛋白通常包含跨膜结构域和富含疏水氨基酸，这使得它们在提取过程中容易发生聚集和沉淀，从而影响提取的完整性和分离的效率。虽然使用强去垢剂可以缓解这些问题，但这些去垢剂往往与后续的质谱分析不兼容。因此，开发一种能够有效处理膜蛋白变性和溶解的新型样品制备方法成为研究重点。

在这一背景下，S-TRAP样品制备方法被证明能够有效处理膜蛋白的变性和溶解，从而提高蛋白组分析的全面性。然而，膜蛋白的球状部分和细胞外环可能阻碍蛋白酶的活性，导致消化后产生的肽段数量较少或过长，这影响了质谱分析的准确性。因此，除了样品制备技术的改进，还需要开发更高效的表面蛋白富集方法。

本研究提出了一种基于呋喃化学的新型方法，通过氧化激活呋喃基团，使其与细胞表面蛋白的赖氨酸和半胱氨酸形成共价键。这种方法不仅提高了表面蛋白的标记效率，还显著减少了对细胞内蛋白的非特异性标记。我们设计并合成了六种呋喃-生物素探针（FB1-FB6），并通过实验验证了它们的性能。其中，FB1表现出最高的染色强度和特异性，且在富集细胞表面蛋白方面比传统的NHS生物素方法更有效。此外，FB1在不同细胞系的表面蛋白分析中也表现出良好的区分能力。

为了评估FB1的反应特性，我们首先将其与模型肽进行反应实验。这些模型肽包括赖氨酸、半胱氨酸和酪氨酸，分别标记在肽的中心位置。实验结果表明，FB1在氧化条件下能够有效地与这些氨基酸反应，形成共价键。通过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）分析，我们确认了模型肽的标记成功，并检测到了预期的质量增加。此外，FB1在与半胱氨酸反应时，还形成了二硫键二聚体，并与共价产物共洗脱。这表明FB1不仅能够特异性地标记细胞表面蛋白，还能够与其他蛋白形成特定的相互作用。

在细胞表面标记实验中，我们使用FB1和FB6对MCF-7细胞进行处理，并通过细胞裂解、生物素富集和固相蛋白消化，进一步验证其富集效果。实验结果表明，FB1和FB6在氧化条件下能够显著富集更多的细胞表面蛋白，且其中大部分被CIRFESS工具标注为表面相关蛋白。与传统的NHS生物素方法相比，FB1在富集细胞表面蛋白时表现出更低的细胞内蛋白非特异性标记，这表明其在表面蛋白富集方面的优越性。此外，通过比较不同细胞系（如MCF-7和MCF-10A）的表面蛋白组，我们发现FB1能够有效区分不同细胞类型，并揭示其表面蛋白的异质性。这种方法不仅提高了表面蛋白的富集效率，还增强了对细胞表面动态变化的分析能力。

通过进一步的功能富集和网络分析，我们发现FB1在MCF-7细胞中富集的312种表面蛋白中，涉及与癌症细胞信号传导和转移相关的生物学“程序”。这些蛋白包括表皮生长因子受体（EGFR）、ERBB家族成员、Eph受体及其配体等，这些蛋白在乳腺癌中常常过表达。此外，富集的蛋白还涉及细胞外渗和细胞黏附等过程，表明这种方法能够揭示细胞表面蛋白在不同生理和病理条件下的功能变化。对于MCF-10A细胞，FB1富集的表面蛋白则主要与细胞黏附相关，包括整合素和钙粘蛋白等。这些结果表明，基于呋喃化学的表面蛋白富集方法不仅适用于癌细胞，也适用于正常细胞的分析。

综上所述，本研究提出了一种基于呋喃化学的新方法，能够有效标记和富集细胞表面蛋白。这种方法在氧化条件下表现出更高的特异性，减少了对细胞内蛋白的非特异性标记，提高了表面蛋白组分析的准确性。此外，该方法在不同细胞系的表面蛋白分析中表现出良好的区分能力，为研究细胞表面动态变化提供了新的工具。未来的研究将进一步优化FB1，以提高其特异性和减少潜在的脱靶效应，从而推动细胞表面蛋白组学在生物医学领域的应用。