《Organic Letters》：Scope and Synthetic Applications of the Aryl-Alcohol Oxidase from Streptomyces hiroshimensis (ShAAO)
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可持续的羰基化合物生产备受关注，本研究发现Streptomyces hiroshimensis来源的ShAAO具有独特的醇氧化活性，可高效催化多种苄基和烯丙基醇生成醛和手性中间体，其中烷醇氧化活性为首次报道。该酶在串联催化中表现出高达65000的转化数，并通过固定化技术实现三次重复使用，适用于规模化生产。
在当前的化学研究中，醛类化合物的可持续生产正受到越来越多的关注，因其在学术和工业领域具有广泛的用途。本研究重点探讨了来自*Streptomyces hiroshimensis*的aryl-alcohol oxidase（ShAAO）的催化特性，分析其在多种醇类底物上的活性表现，并揭示其与其它天然AAO的不同之处。ShAAO被成功整合到串联的有机催化反应中，实现了多种手性化合物的合成，包括用于合成帕罗西汀的关键中间体。在实验室规模的反应中，ShAAO表现出超过65000的高转化率和高产率，这表明其在工业应用中的潜力。此外，通过固定化技术进一步提升了ShAAO的稳定性，使其成为一种高效且适用于工业生产的生物催化剂。
醇氧化反应是有机合成中的核心步骤之一，而酶促方法相较于传统的化学方法具有更高的实用性和环境友好性。例如，酮还原酶（KREDs）通过将氢转移至烟酰胺辅因子来催化可逆的醇氧化反应，但这种反应在热力学上并不有利，需要辅因子的回收。此外，漆酶作为一种蓝铜氧化酶，也已被用于介导醇氧化反应，但其较低的氧化还原电位意味着需要使用媒介物，这在大规模应用中带来了复杂性。相比之下，黄素依赖性醇氧化酶（FAD-AOx）通过将氢转移至FAD，然后由氧气再生，产生H?O?，而无需添加额外的辅因子，因为FAD通常在酶的生产过程中紧密结合于酶上。这些优势使得FAD-AOx在合成应用中备受关注。为了满足这一需求，已有研究对*Arthrobacter chlorophenolicus*的choline oxidase（AcCO6）以及*Pleurotus eryngii*的AAO（PeAAO）的不同异构体和工程变体进行了广泛研究。这些酶的高效率以及在高底物负载下的良好表现，使其成为工业生物技术中极具前景的工具。
本研究进一步拓展了对细菌来源的AAO的底物范围和应用潜力的探索，特别是在构建化学-酶促串联反应（chemoenzymatic cascades）以实现醛类和手性合成中间体的可扩展合成方面。通过构建包含生物氧化和有机催化反应的体系，ShAAO能够在不纯化中间产物的情况下，高效地合成复杂分子。这种策略不仅提高了对不稳定或有毒中间体（如醛类）的转化效率，还增强了反应的安全性和整体效率。
为了确定ShAAO的底物范围，我们测试了其在分析规模下的催化活性，包括60种不同类型的伯醇和仲醇（
Scheme 1，完整列表见
Figure S1）。结果表明，ShAAO对脂肪族和芳香族烯醇表现出强烈的偏好，如肉桂醇（1a）或2,4-己二烯-1-醇（9a），其转化率在初始条件下达到15000到35000。肉桂醇衍生物（2a–6a）也表现出相似的转化率，但其中间位硝基取代的衍生物（5a）仅在59%的转化率下获得，这可能是因为空间位阻效应。值得注意的是，丙炔醇（7a）也被成功氧化，尽管转化率较低（TN 909）。脂肪族烯醇（8a–12a）则被高效氧化，其中对于己二烯-1-醇（9a）、反式-2-己烯-1-醇（11a）和香叶醇（12a）表现出特别高的转化率，达到接近完全的转化和35656的TN。有趣的是，酶对结构相似的化合物如47a或49a（
Figure S1）则无活性。此外，对芳香醇衍生物（13a–31a）的测试也显示了良好的催化效果。在真菌来源的AAO中，其底物范围包括富电子的芳香醇（22a–25a），其中对于甲基取代的衍生物，其TN较低，仅为636，而对于对位取代的化合物，如24a，其TN高达12371，显示出显著的催化效率差异。
在卤代化合物（14a–18a）的测试中，我们发现ShAAO对对位取代的衍生物表现出更高的偏好，其转化率从对位溴苯甲醇（15a）的78%下降到间位溴苯甲醇（16a）的31%，而邻位溴苯甲醇（17a）则无活性。这一现象在对位氟、氯和溴取代的化合物中尤为明显。例如，ShAAO对对位溴苯甲醇（15a）表现出高活性，但对对位氯苯甲醇（14a）和对位氟苯甲醇（18a）的TN分别降低了10倍和20倍，这表明活性位点的结构对催化效率和特异性具有显著影响。在硝基芳香醇（19a–20a）的测试中，我们也发现对位取代的化合物具有较高的催化活性，其TN分别为3820和6731。此外，我们还测试了芳香环中羟基和氨基取代的化合物，发现ShAAO对酚类化合物（25a）具有一定的活性，但对苯胺（26a）则无反应。对于杂芳香醇（27a–31a）的测试也显示了ShAAO的广泛适用性，特别是呋喃衍生物，这些化合物在生物塑料的合成中具有重要价值。ShAAO对糠醛（28a）表现出显著的活性，其TN达到16000。然而，与*Pleurotus eryngii*的PeAAO相比，ShAAO对某些杂芳香醇如27a则无活性。这表明ShAAO在底物范围上与真菌来源的AAO存在差异。有趣的是，3-吡啶甲醇（31a）被成功氧化，其转化率为29%（TN 5726），而2-吡啶甲醇（30a）则仅检测到微量产物，这进一步说明了ShAAO对底物结构的严格选择性。
在非活化醇（nonactivated alcohols）的测试中，ShAAO表现出对直链脂肪醇的活性，如从1-戊醇（33a）开始，其TN为364，随着底物链长的增加，活性逐渐增强，直到1-壬醇（37a）达到40%的转化率和3636的TN。然而，对于更长链的醇，如1-十七醇（40a），活性下降并变得难以检测。值得注意的是，ShAAO是首个能够氧化烷醇的天然AAO，这扩展了该酶类的已知底物范围。此外，我们还测试了ShAAO对那些不被其接受的伯醇和仲醇（部分例子见
Figure S1）。尽管ShAAO与PeAAO的活性位点结构相似，但其对仲醇的催化活性受到空间位阻的限制，导致其在某些情况下无法有效进行氢转移反应，从而显著降低或完全阻止氧化反应的发生。此外，尽管*Ac*CO6在催化活性上可能不如ShAAO，但其底物范围与ShAAO相似，这表明ShAAO在催化效率和底物适应性上具有更高的表现。
为了进一步验证ShAAO在合成中的应用潜力，我们测试了其在单锅反应中的催化活性，将生物氧化过程与有机催化反应以及Wittig反应相结合。在这一过程中，我们首先评估了Hayashi-J?rgensen催化剂（I）在肉桂醇（1a）的催化活性，获得了（S）-1c的61%收率和超过99:1的对映选择比（e.r.），这表明该催化剂在合成中的高效性。由于4-氟肉桂醇（S）-2c是（?）-帕罗西汀的合成前体，我们还测试了从4-氟肉桂醇（2a）开始的反应，获得了（S）-2c的52%收率和95:5的e.r.。此外，ShAAO在饱和脂肪醇的氧化反应中表现出独特的特性，而真菌来源的氧化酶则无法氧化饱和脂肪醇。因此，ShAAO在合成中的适用性更为广泛。
在进一步的合成测试中，我们评估了ShAAO在非对映选择性反应中的表现，使用了不同的催化剂，如基于烯胺催化机制的催化剂，以合成手性羟基酮。在这一过程中，我们选择了在水相中进行醛醇反应的催化剂，如脯氨酸衍生物（III）和Singh催化剂，因其在合成中的简便性和高效性。从20a开始的反应中，催化剂III表现出更优的性能，获得了（S,R）-20c的50%收率，97:3的e.r.，以及12.5:1的对映比（dr.）。此外，我们还测试了4-溴苯甲醇（15a）的反应，获得了（S,R）-15c的99%收率，超过99:1的e.r.，以及20:1的dr.，这表明ShAAO在合成中的高选择性和高效率。
在构建生物氧化与Wittig反应的串联反应中，我们选择了香叶醇（12a）作为底物，并使用了两种磷叶基试剂，分别获得了12c和12d的62%和97%收率。这一过程在高底物浓度下进行，且所需的催化剂负载较低，相较于之前报道的串联反应更为高效。此外，我们还评估了ShAAO在制备规模反应中的表现，使用1a作为底物（
）。初始实验中，1 mL反应在10 mL反应瓶中进行，随着1a浓度的增加，其转化率从120 mM（16 g/L）的48%提升到240 mM（32 g/L）的92%和500 mM（69 g/L）的48%，对应的TN为51349，TOF为349 min?1（
，
Figure S53）。考虑到氧气浓度和转移速率的重要性，我们还测试了不同催化酶浓度、反应瓶体积以及使用O?气氛的影响，但未发现显著的提升效果。然而，分步添加催化酶（2 × 8000 U/mL）略微提高了转化率，达到57%（TN 64390），且未观察到更高的催化酶浓度带来的进一步提升。在这些条件下，我们进行了克级反应，使用2 × 10 mL反应体积和100 mL带搅拌的烧瓶以提高氧气供应。反应后6小时，我们观察到42%的转化率，并通过柱层析分离获得了422 mg的2a（33%的收率和168 g产物/g催化酶的产率）。随后，我们尝试使用细胞外提取物（CFE）进行反应，根据催化酶的表达和纯化数据，我们估计4.3 μM的ShAAO对应2 mg/mL的CFE。使用CFE的反应获得了61%的转化率和53%的收率（17.1 g产物/g CFE），这表明CFE对催化酶性能的稳定作用具有积极影响。为了最大化产率，我们最终将CFE浓度提高到4 mg/mL，获得了94%和91%的转化率，通过反应粗产物的纯化，最终获得了2a的75%收率（0.96 g，12 g产物/g CFE）。
为了进一步提高和验证ShAAO作为可重复使用的生物催化剂的合成价值，我们测试了其固定化技术的应用。我们尝试了多种亲和树脂（EziG Amber、Coral和Opal）、氨基戊二醛树脂（ECR8309F）以及环氧树脂（EMC7025）。然而，在室温下进行固定化时，由于酶的沉淀，效果不佳，且在树脂存在下，沉淀加速。因此，我们选择在4°C下进行固定化。初始测试中，Opal和Amber树脂表现出较高的转化率，分别为86%和55%（
Figure 1）；但在后续的两次反应循环中，其活性出现下降（
Figure 2）。从这些结果可以看出，ECR8309F树脂是唯一在三次90分钟反应中未表现出活性损失的载体，这表明其在重复使用和可扩展反应中的适用性。此外，尽管活性在某些情况下有所下降，但总体TN仍超过65000，这使得同一份酶可以被分离并重复使用三次（
）。
综上所述，我们展示了ShAAO在伯醇选择性氧化中的广泛底物适应性、高催化效率以及可扩展应用的潜力。ShAAO在烯醇和苯醇的氧化反应中表现出显著的高TN（最高超过50000），并且是首个能够氧化烷醇的天然AAO，这扩展了该酶类的已知底物范围。此外，生物氧化过程成功整合到多个化学-酶促串联反应中，使得有价值的手性化合物的高效合成成为可能。更重要的是，ShAAO在制备规模应用中也展现出良好的潜力，克级反应在纯化酶和CFE的应用下取得了高产率。尽管PeAAO在某些底物上表现出更高的TN值，但ShAAO因其易于生产和在半纯化形式下的有效使用，成为更实用的替代选择。通过固定化技术，ShAAO的稳定性得到提升，使其能够在三次反应循环中重复使用，达到超过65000的总TN。这些独特的性质使得ShAAO成为一种在可持续合成应用中具有广泛适用性的多功能生物催化剂。
