RNAi喷雾诱导EPSPS基因沉默：一种新型杂草控制策略在光滑蒺藜草中的应用研究

《Frontiers in Plant Science》：RNAi spray-induced gene silencing of EPSPS by topical application of dsRNA in the weed Digitaria insularis

本文推荐了一项利用RNA干扰（RNAi）技术，通过叶面喷洒双链RNA（dsRNA）靶向沉默光滑蒺藜草（Digitaria insularis）中5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因的研究。该研究证实了喷雾诱导基因沉默（SIGS）策略能有效抑制目标基因表达，导致杂草生物量（干重降低44%）和分蘖数（减少75%）显著下降，为开发可持续、靶向性的新型生物除草剂提供了重要实验依据。

　　

RNAi喷雾诱导基因沉默EPSPS：通过叶面施用dsRNA控制光滑蒺藜草

引言

随着谷物种植面积的扩大以满足农业产业需求，实施更高效、可持续和综合的管理实践以减轻抗性害虫和杂草的选择压力变得十分必要。由于化学除草剂的密集使用，除了对环境造成影响外，还导致了杂草种群（如光滑蒺藜草）抗性机制的发展。这些机制使管理 efforts 复杂化，增加生产成本，并降低生产力。在此背景下，RNA干扰（RNAi）技术因其在转录后沉默关键基因方面的特异性，已成为一种有前景的靶向控制杂草的分子工具。光滑蒺藜草是巴西作物中影响最大的杂草之一。这种高度适应性的物种激烈竞争水、光、养分等必需资源。它通过种子和根状茎发芽两种方式传播，其根状茎是储存能量的地下营养结构，这使得对其控制尤为困难。由于其高活力和广泛分布，该物种严重影响了拉丁美洲谷物作物的农业生产力。对光滑蒺藜草和其他杂草的控制主要依赖于化学除草剂的广泛使用。然而，这些物质的密集和 indiscriminate 应用除了造成不利的环境影响外，还促进了耐受或抗性种群的选择。

长期以来，在免耕田广泛采用草甘膦作为控制光滑蒺藜草的主要方法。然而，多年来，已产生草甘膦抗性的杂草种群不断增加，这已成为一个重大挑战。草甘膦耐受性主要与靶标位点因素有关，即5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）。EPSPS是莽草酸途径中芳香族氨基酸生物合成的关键磷酸酶，也是草甘膦的作用靶点。基因拷贝数的扩增可导致酶转录增加，此外，改变活性位点的突变也会导致抗性。而且，其他非靶标位点因素，如形态变化和细胞解毒代谢的改变，也 contribute to 抗性。

多重抗性和不可成药靶点种群的出现，警示着迫切需要开发新的杂草控制工具。在此背景下，新技术不断涌现，专注于开发可持续且有效的杂草管理替代方案。其中，RNA干扰（RNAi）尤为突出。RNAi是一种基于基因转录后沉默的自然细胞防御机制，存在于真核生物中，作为抵御病毒和外源转座元件的细胞防御形式。该途径正在多个方面被探索，其中最有前景的方向之一是开发用于叶面施用的制剂（喷雾诱导基因沉默 – SIGS），旨在沉默感兴趣的靶基因。

RNAi介导的基因沉默机制由外源双链RNA（dsRNA）分子激活。当这些分子进入植物细胞后，被DICER酶识别并加工成21至24碱基对的小干扰RNA（siRNA）。siRNA随后被纳入RNA诱导的沉默复合体（RISC）。其核心蛋白Argonaute（AGO）利用siRNA的引导链识别并切割靶信使RNA（mRNA），导致其降解和随后的基因表达沉默。

SIGS技术在植物中的巩固面临几个瓶颈，最主要的是向细胞的有效递送。植物具有多重叶片屏障，如 rigid 细胞壁和选择性质膜，这些屏障阻止像dsRNA这样的大分子、带电分子的渗透，此外，还有疏水性的蜡质角质层，该角质层在禾本科植物中增厚且特化。考虑到这一背景，本研究旨在勘探编码EPSPS酶的基因，以设计特定的dsRNA序列。这些dsRNA通过细菌发酵合成、纯化，并在使用光滑蒺藜草的生物测定中进行叶面施用，以评估通过RNAi技术沉默EPSPS基因的潜力。

材料与方法

植物材料

使用来自Embrapa大豆杂草科学部门种子库的、已知对除草剂敏感的名为Guaporema（登录号: ID_0903）的光滑蒺藜草生态型的种子。将种子播撒在装有土壤和基质以3:1比例混合的1升盆中。其发芽率非常高，符合禾本科植物的特性，幼苗在温室中受控温度（20°C至30°C）下保持，每天灌溉两次。出苗后15天进行间苗，以标准化每盆三株最高的、具有三片完全展开叶（不计子叶）的幼苗，用于生物测定。

dsRNA施用生物测定

为了评估dsRNA施用对光滑蒺藜草中EPSPS基因沉默的影响，进行了叶面喷雾施用的生物测定。施用载体为10mM磷酸盐缓冲液（pH 6.5），补充了0.1%的Silwett佐剂。施用于清晨进行，使用校准为15 PSI（1 bar）压力的喷笔。每个处理约施用3mL含有磷酸盐缓冲液和Silwett佐剂的溶液。在特定处理中，掺入了靶向EPSPS基因的dsRNA，浓度为100 ng·μL^?1。施用后，植物保持24小时不灌溉。

在dsRNA施用后48小时，仅在先前定义的处理上进行草甘膦除草剂施用，浓度为1.5 L·ha^?1。除草剂施用后，植物再次保持24小时不灌溉。

实验设计采用完全随机设计，每个处理13个重复。每个重复由三株先前选定的、在高度和物候期上均匀的植物组成，确保在施用时有三片完全展开叶。

处理后五天，收集叶片样本，每个处理三个生物学重复，并立即在液氮中冷冻用于分子分析。施用后二十天，进行分蘖计数和地上部收集以测定干重。样品放入纸袋，在56°C烘箱中干燥48小时，并在精密分析天平上称重。

EPSPS基因dsRNA分子的获取与生产

光滑蒺藜草EPSPS基因的提取与测序

首先，从GenBank数据库检索了属于禾本科物种的EPSPS基因序列，包括Panicum halli、Panicum virgatum、Setaria viridis和Setaria italica。使用Genefisher2比对编码序列以生成共有序列。比对后，用FastTree软件构建系统发育树，并在iTol中编辑。

对于基因组DNA提取，在液氮中收集的光滑蒺藜草叶片样本储存在-80°C冰箱中以保存核酸用于后续提取。使用CTAB缓冲液按照Doyle和Doyle的方案提取基因组DNA。通过Nanodrop分光光度法进行DNA定量，通过1%琼脂糖凝胶电泳验证完整性。

共有序列用作模板，使用Primer3Plus软件设计特异性引物。这些引物用于以基因组DNA为模板扩增光滑蒺藜草EPSPS基因片段。生成的扩增子通过测序验证，旨在与所使用的CDS集找到对应关系。为此，进行高保真PCR反应，反应条件包括95°C初始变性5分钟，随后35个循环的94°C 30秒、各引物对特异性退火温度30秒、68°C 40秒，最后72°C终延伸7分钟。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳验证，随后纯化用于测序。使用BigDye? Terminator v3.1 Cycle Sequencing试剂盒按照制造商说明在ABI3500设备上进行测序。

通过发酵获取和生产EPSPS基因的dsRNA分子

通过测序获得的EPSPS基因片段使用siRNA Wizard软件进行分析。目的是基于DICER酶的 preferential 切割位点，识别具有最高siRNA生成潜力的区域。从该分析中，选择了一个具有最高有效性概率的区域，并提交进行脱靶分析，使用BLASTn将该片段与三个关键物种（玉米、普通小麦和大豆）的基因组进行比对。使用IBS 2.0软件将dsRNA序列与基因比对进行注释。

靶向EPSPS基因的dsRNA（dsRNA-EPSPS）的合成在Embrapa大豆植物生物技术实验室完成。这是通过在用含有dsRNA-EPSPS插入片段的pClone_VR载体转化的Escherichia coli HT115（DE3）中进行细菌表达实现的。pClone_VR载体在由双向T7启动子和终止子 flanked 的多克隆位点中，用限制性内切酶BsmBI消化后，使用T4 DNA连接酶以5‘-3’方向连接插入片段进行组装。通过热激进行细菌转化，随后在补充有四环素和氨苄青霉素抗生素的液体LB培养基中培养重组菌落。

通过添加乳糖诱导dsRNA表达，将培养物在37°C、180 rpm振荡条件下保持五小时。此后，以4000 g离心5分钟收集细胞，细菌沉淀使用TRIzol?试剂按照Da Rosa等人的描述进行总RNA提取。随后，通过用DNase和RNase A处理以去除DNA和单链RNA来进行RNA纯化。

纯化通过加入酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）进行，剧烈振荡后，以12,000 ×g离心15分钟。转移上清至另一管，加入NH₄OAc和异丙醇，样品在4°C以12,000 ×g离心45分钟。此步骤之后用70%乙醇洗涤两次并离心。沉淀干燥后重悬于无核酸酶水中。

纯化的dsRNA通过Nanodrop在260 nm分光光度法定量，并通过1%琼脂糖凝胶电泳评估完整性和预期大小。

通过RT-qPCR进行基因表达分析

RNA提取与cDNA合成

按照Oliveira等人建立的方案进行总RNA提取。使用Nanodrop分光光度计评估RNA浓度和纯度，并通过1%琼脂糖凝胶电泳分析其完整性。为消除可能的基因组DNA污染，使用DNase I处理RNA样本。

使用SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒，以信使RNA（mRNA）为模板进行cDNA合成。通过用相同的EPSPS基因特异性引物进行PCR，随后在1%琼脂糖凝胶上验证，评估DNase I处理和cDNA合成的效率。

基因表达分析

使用Platinum? SYBR Green? qPCR SuperMix-UDG with ROX试剂盒，在7900HT Fast Real-Time PCR System上进行RT-qPCR反应，每个样本设三个技术重复。使用Primer3Plus软件设计引物。扩增方案包括95°C初始变性10分钟，随后40个循环的95°C 15秒和60°C 1分钟（退火和延伸）。最后，进行解离曲线分析，逐步升温至95°C 15分钟，随后冷却至60°C 1分钟。

通过用cDNA系列稀释液生成标准曲线来确定EPSPS基因定量引物的效率。基于曲线斜率计算效率指数（E）。通过分析解离曲线的峰来验证扩增产物的特异性。

使用2^?ΔΔCt方法定量EPSPS基因的相对表达量。使用丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（2APP）和β-微管蛋白（β-Tub）参考基因作为校准子进行数据分析和标准化。

统计分析

实验收集的数据在进行方差分析（ANOVA）前，验证了正态性（Shapiro-Wilk检验）、方差齐性（Bartlett检验）和残差独立性（Durbin-Watson检验）的假设。平均值通过Duncan检验进行分析。对于两个因素之间的比较，首先使用Shapiro-Wilk检验验证正态性假设。由于数据不服从正态分布，应用Mann-Whitney U检验评估组间差异。

结果

dsRNA-EPSPS的勘探与生物合成

对来自系统发育相关物种的EPSPS基因进行多序列比对分析，揭示了一个约1100 bp的保守片段，这使得构建系统发育树和设计引物成为可能。测序 reads 用于重建约420 bp的EPSPS基因片段，该片段用于选择dsRNA靶标区域以及设计用于克隆和qRT-PCR的引物。

这使得能够继续进行带有插入片段的pClone_VR载体的组装，以及使用适当转化的E. coli HT115菌株通过细菌发酵生产dsRNA。纯化后，dsRNA在分光光度法下达到2707 ng·μL^?1，生物测定中每个处理获得并施用约100 ng·μL^?1的dsRNA。

叶面dsRNA施用生物测定

在光滑蒺藜草上叶面施用靶向EPSPS基因的特异性dsRNA，促进了处理植株的显著表型变化。与对照组相比，仅暴露于dsRNA的组观察到地上部干重平均减少44%，同时分蘖数显著减少75%。这些效应表明与靶基因的部分沉默相关的直接生理影响。

施用商业剂量1.5 L·ha^?1草甘膦的处理在施用后7天内即对植株产生致死效应。鉴于本研究所用生态型对除草剂敏感，此效应是预期的。除草剂反应导致该实验组重复中无生物量和分蘖，使得后续定量数据收集无法进行。

生物测定后EPSPS基因的相对表达

使用生物测定施用后五天收集的样本，进行了RT-qPCR分析。观察到用dsRNA处理的光滑蒺藜草中EPSPS基因的相对表达显著降低，达到仅用载体溶液处理的对照表达水平的36%。差异具有统计学显著性，表明RNAi技术的沉默是部分的。

此外，在单独施用草甘膦的处理中检测到EPSPS转录本显著增加，这表明了由除草剂引起的化学胁迫诱导的适应性转录反应。然而，dsRNA和草甘膦的联合施用显示相对表达无变化，表明适应性转录反应补偿了RNAi促进的沉默。

本研究中观察到的通过RNAi部分降低EPSPS基因表达，以及干重和分蘖减少的表型效应，证明了该技术在开发基于叶面生物导向除草剂或SIGS的解决方案方面的潜力。

讨论

dsRNA-EPSPS的勘探与生物合成

尽管光滑蒺藜草具有农学相关性，但其基因组和转录组数据在公共数据库中仍然稀缺。从同一科物种的多重比对中选择EPSPS基因的保守区域，代表了一种有效的基因勘探策略，特别是对于那些参与关键代谢途径（如莽草酸途径中的EPSPS）且功能完整性至关重要的基因。研究表明，使用直系同源序列可以识别用于引物设计的理想片段和具有良好特异性的dsRNA靶标区域。

通过细菌发酵过程生产dsRNA是一种 consolidated 且相对低成本的、用于农业应用分子大规模生成的替代方案。该技术已被证明前景广阔，特别是与确保无污染物的纯化方法相结合，以及使用乳糖作为诱导剂以优化生产和生物合成成本时。此外，该方法的可行性已在真实世界系统中得到证明，例如在普通小麦上的工作，为开发基于RNAi的生物除草剂指明了一条可行之路。

叶面dsRNA施用生物测定

生物测定中观察到的干重和分蘖表型结果表明dsRNA在基因沉默中的作用，直接干扰了植物的营养发育。这很可能是由于由莽草酸途径介导的芳香族氨基酸合成受到限制所致，类似于在该途径上起作用的抑制剂所观察到的情况。

生物测定结果与先前在多种植物上的研究结果相印证，这些研究通过叶面RNAi应用成功沉默了内源基因，并观察到沉默后的表型效应，与本研究中光滑蒺藜草观察到的相似。

不同之处在于施用载体溶液的配方。本研究使用了Silwett-L77作为佐剂。这类物质的表面活性剂效应使得dsRNA分子在叶片组织中 better 铺展和吸收，有助于克服像角质层和细胞壁这样的屏障，这些屏障是植物抵御外源 agent 的 defense。

生物测定后EPSPS基因的相对表达

叶面施用dsRNA导致光滑蒺藜草中EPSPS基因的部分沉默，与文献证据一致，即RNA干扰技术可有效调控农业植物中的必需基因。先前的研究证明了通过外源dsRNA应用减少基因表达的成功，以及像本研究中这样的部分下调。文献将这种部分沉默效应归因于dsRNA递送和dicer适当加工的缺陷，但分子改进可能会提高沉默效率，以验证该方法在杂草物种中作为一种可行策略。

在本研究中，除了相对EPSPS表达降低外，还观察到当植物暴露于草甘膦时基因表达增加，这表明了一种由化学胁迫诱导的转录上调机制。这种类型的适应性反应可以通过芳香族氨基酸的瞬时缺乏和莽草酸积累作为调节信号来解释。这已在其他杂草物种中得到记载，强化了EPSPS作为克服草甘膦抗性挑战的战略靶点的相关性。

尽管RNAi在靶向控制杂草方面具有明显潜力，但其大规模应用的主要挑战之一在于优化dsRNA分子的递送过程。基因干扰的有效性直接关系到dsRNA的稳定性、其穿透植物组织的能力以及其到达靶mRNA前的功能完整性。dsRNA分子在植物中的细胞摄取机制仍在 recent 文献讨论中，描述了500 bp dsRNA的体外细胞摄取，但仅限于拟南芥细胞。缺乏信息是由于在植物中重现和实施细胞摄取测定的困难，因为其特化的细胞壁和高度选择性的膜，这两者都代表了dsRNA摄取的重要物理屏障，特别是对于像dsRNA这样的长分子。

本研究中获得的部分沉默可以通过使用提高dsRNA分子沉默潜力和递送效率的策略来克服。最近的进展指出了有前景的替代方案，特别是通过应用于递送的纳米技术。在这些方法中，使用纳米颗粒进行保护和肽作为载体尤为突出，此外还有对dsRNA分子进行直接化学修饰，这可以增加其对抗核酸酶降解的稳定性并促进其在植物细胞中的内化。

此外，RNAi作为商业农业技术的巩固面临技术和科学瓶颈，例如杂草物种基因组数据的稀缺、配制稳定产品的困难，以及最重要的，可行的、有效的递送机制到作用位点。

迄今为止，市场上仅正式推出了一款基于RNAi的产品：“Calantha”，由GreenLight Biosciences开发，用于控制科罗拉多马铃薯甲虫。植物和后生动物在RNAi方法上存在许多不同的瓶颈，主要瓶颈在于验证靶基因和递送策略的难易程度不同，因为后生动物不像植物那样有许多阻碍直接叶面施用的屏障。基于叶面施用dsRNA “Ledprona” 的配方，代表了基因沉默作为传统杀虫剂使用替代方案有效性的首个工业化验证案例，并为未来的倡议和RNAi技术的验证提供了模型。

结论

本研究的结果表明，叶面施用靶向EPSPS基因的双链RNA（dsRNA）部分沉默了光滑蒺藜草中的基因表达。这导致了可测量的表型影响，包括干重和分蘖数的减少。施用dsRNA后EPSPS基因的表达显著降低，证实了RNAi机制在所研究物种中的作用。这些发现强化了RNAi技术作为一种分子策略用于靶向控制具有农业重要性的杂草的可行性。

观察到的转录反应也揭示了在除草剂存在下EPSPS表达的诱导。这印证了该基因在响应化学胁迫中的调节作用，并强调了其沉默作为综合管理工具的相关性。因此，本工作为巩固RNAi作为一种有前景的生物技术方法提供了重要的实验证据，为开发基于杂草中基因靶向沉默的新一代除草剂铺平了道路。