Nestin与SOX2分别维持不同胰腺癌干细胞群体的自我更新能力——探索肿瘤细胞可塑性的关键调控因子

《Stem Cell Reviews and Reports》：Nestin and SOX2 Maintain self-renewal Abilities of Different Pancreatic Cancer Stem Cell Populations

本研究聚焦胰腺导管腺癌（PDAC）中肿瘤细胞可塑性与癌症干细胞（CSC）特性的关联。为解决PDAC转移和治疗抵抗的临床难题，研究人员以不同上皮-间质转化（EMT）表型的PDAC细胞为模型，通过siRNA敲低技术靶向CSC标志物Nestin和SOX2，系统评估其对恶性特征的影响。结果表明，Nestin和SOX2分别是间质样和上皮样PDAC细胞自我更新能力的关键介质，但对细胞增殖、EMT标志物表达、迁移侵袭及化疗反应影响有限。此发现揭示了PDAC中CSC表型的异质性调控机制，为针对肿瘤可塑性的治疗策略提供了新视角。

　　

胰腺导管腺癌（PDAC）是恶性程度最高的肿瘤之一，其五年生存率仅为11%左右，堪称“癌王”。患者预后极差的主要原因在于早期诊断困难、易发生肝肺转移，以及对化疗药物的抵抗。手术切除是目前唯一可能根治的手段，但超过80%的患者确诊时已处于晚期，失去了手术机会。肿瘤转移和治疗抵抗的背后，隐藏着一个关键推手——肿瘤细胞的可塑性。这种能力让癌细胞像变形金刚一样，在不同状态间灵活切换，例如从增殖状态转变为侵袭状态，从而适应不断变化的微环境。

上皮-间质转化（EMT）是癌细胞获得侵袭能力的重要过程，同时与癌症干细胞（CSC）特性的获得密切相关。CSC具有自我更新、抵抗化疗和启动肿瘤生长的能力，是肿瘤复发转移的“种子细胞”。然而，PDAC中的CSC并非铁板一块，它们表现出高度的异质性。此前，Lisa-Marie Philipp等研究人员发现，源自间质样Panc1细胞的CSC克隆高表达Nestin，而上皮样Panc89细胞的CSC克隆则高表达SOX2，提示不同EMT背景下的CSC可能由不同的分子机制主导。为了厘清Nestin和SOX2在这些不同CSC表型中的具体功能，研究人员在《Stem Cell Reviews and Reports》上发表了最新研究成果，系统阐述了这两个关键因子对PDAC细胞恶性表型的调控作用。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术：利用siRNA介导的基因敲低（KD）技术在异质性（亲代）和CSC（Holoclone）PDAC细胞群体中分别或同时敲低NES和SOX2的表达；通过实时定量PCR（RT-qPCR）和免疫荧光染色（IFS）验证敲低效率并检测基因和蛋白水平变化；采用集落形成实验（CFA）评估细胞的自我更新能力；使用细胞迁移和三维Matrigel侵袭实验分析细胞的运动与侵袭潜能；并通过细胞计数和药物处理（吉西他滨、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂）后的细胞活力/死亡检测，评估其对细胞生长和化疗反应的影响。

SiRNA-mediated KD leads to a significant reduction of NES expression in Panc1 cell variants and SOX2 expression in Panc89 cell variants.

研究人员首先成功建立了稳定的siRNA敲低模型。在Panc1细胞变体（亲代和Holoclone）中敲低NES，可使其基因表达降低70-80%，蛋白水平下降约80%，且不影响SOX2。在Panc89细胞变体中敲低SOX2，使其基因表达降低60-70%，蛋白完全消失，同时意外地引起NES基因表达上调1.5-2.0倍。同时敲低NES/SOX2也证实了双基因的有效沉默。这些结果为后续功能研究奠定了基础。

KD of NES in Panc1 and KD of SOX2 Panc89 cell variants slightly modulate gene expression of EMT marker and plasticity modulators.

敲低Nestin或SOX2对EMT标志物和可塑性调节因子表达的总体影响较小。最显著的变化是，敲低NES使Panc1细胞变体的上皮标志物E-钙黏蛋白（CDH1）表达上调，暗示其可能向更上皮的表型转变。同时敲低NES/SOX2在Panc1细胞变体中进一步增强了L1CAM和Vimentin（VIM）表达的下降趋势。在Panc89细胞中，SOX2敲低也引起CDH1的短暂上调，但双敲低则逆转了这一效应。可塑性关键调节因子ZEB1、ZEB2的表达受到轻微影响，而OVOL2的变化不显著。值得注意的是，这些基因层面的变化并未在蛋白水平得到验证，提示Nestin和SOX2对PDAC细胞EMT特征的直接调控作用有限。

KD of NES in Panc1 cell variants and KD of SOX2 in Panc89 cell variants marginally impact cell growth but significantly decreases self-renewing properties.

功能分析显示，敲低NES使Panc1细胞变体，尤其是Holoclone细胞的活细胞数量显著减少，这与Nestin在维持细胞增殖中的作用相符。敲低SOX2对Panc89细胞生长影响微弱。然而，集落形成实验揭示了关键发现：虽然敲低Nestin或SOX2对形成的集落总数影响不大，但它们显著减少了具有强干性潜能的Holoclone集落的数量。这表明Nestin和SOX2 specifically影响了CSC的自我更新能力。同时敲低两个基因并未产生叠加效应，暗示PDAC细胞的自我更新能力可能通过不同机制（依赖于Nestin或SOX2）维持，进一步支持了PDAC中存在着不同的CSC群体。

KD of NES in Panc1 cell variants and KD ofSOX2 in Panc89 cell variants marginally affect migration and invasion properties.

敲低Nestin对Panc1细胞变体的迁移和侵袭能力影响甚微，仅亲代Panc1细胞的迁移有轻微增加。敲低SOX2则使Panc89细胞变体的侵袭能力呈现下降趋势。这些结果与EMT标志物表达仅轻微改变的结果相一致，表明Nestin和SOX2单独并非调控这些PDAC细胞变体迁移侵袭的关键因子。

KD of NES in Panc1 cell variants and KD of SOX2 in Panc89 cell variants only marginally impact the response to cytostatic drugs.

在化疗反应方面，敲低NES并未显著改变Panc1细胞变体在吉西他滨、5-FU或奥沙利铂处理后的细胞核总数，但亲代Panc1细胞的死亡数量略有增加。相反，敲低SOX2后，Panc89细胞变体在化疗药物作用下的细胞核数量反而增加，同时细胞死亡率呈下降趋势，这与SOX2通常促进化疗抵抗的预期相反。研究者推测，SOX2敲低后引发的NES表达上调可能在一定程度上补偿了其功能，或者这些CSC因子的效应高度依赖于细胞内的其他协同调控因子。

综上所述，本研究得出结论：Nestin和SOX2分别是间质样和上皮样PDAC细胞变体自我更新能力的关键介质，但它们对于维持其他恶性特征（如增殖、迁移、侵袭和药物反应）并非决定性因素，提示需要其他因子共同参与。这项研究强调了PDAC肿瘤细胞可塑性和CSC异质性的复杂性，不同CSC表型可能由不同的核心分子机制驱动。研究结果深化了对PDAC恶性生物学行为的理解，为开发针对特定CSC亚群的精准治疗策略提供了重要的理论依据。未来研究需要进一步揭示在Nestin或SOX2缺失情况下，其他因子如何补偿以维持CSC功能，以及这些不同CSC群体在体内肿瘤发生和转移中的动态相互作用。