基于葡聚糖多聚体的CAR-T细胞检测与功能评估新方法开发

《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Development of antigen multimers for detection and evaluation of CAR T cells

本研究针对CAR-T细胞治疗中检测工具特异性不足、功能评估能力有限的问题，开发了抗原多聚体技术。研究人员通过将CAR靶抗原偶联至葡聚糖骨架，构建了可同时实现高灵敏度检测和功能性激活的双功能试剂。结果表明，该多聚体不仅能精准识别不同亲和力的CAR结构，还可通过调控抗原密度揭示CAR聚类特性与激活效力的内在关联，为CAR设计优化提供了新型分子平台。

　　

随着嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在血液肿瘤治疗领域取得突破性进展，如何精准监测这类"活药物"在体内的动态变化成为临床实践的新挑战。传统检测方法如多克隆抗IgG抗体、蛋白L等存在非特异性结合强、兼容性差等问题，而高特异性的抗独特型抗体又面临开发成本高、通用性低的局限。更关键的是，现有试剂大多只能实现≤2价结合，无法有效模拟生理状态下CAR与靶抗原的多价相互作用，且缺乏对CAR-T细胞功能状态的评估能力。

针对这一技术瓶颈，丹麦技术大学与莱布尼茨免疫治疗研究所的研究团队创新性地开发了基于葡聚糖骨架的抗原多聚体技术。该技术通过将生物素化CAR靶抗原与荧光标记的葡聚糖-链霉亲和素复合物结合，形成可调控抗原密度的多价检测试剂。研究人员系统比较了该多聚体与传统四聚体的性能差异，并选取了四种具有不同亲和力的第二代CAR（抗CD19、抗CD79b、抗CEA和抗HER2）进行验证，所有CAR均包含CD8铰链/跨膜结构域以及CD28、4-1BB、CD3ζ信号结构域。

在技术方法层面，研究团队首先通过慢病毒转导在Jurkat、SupT1细胞系及原代人类T细胞中表达CAR蛋白，利用流式细胞分选获得纯化细胞群体。随后采用梯度抗原偶联法构建不同抗原密度的葡聚糖多聚体，通过流式细胞术、共聚焦显微镜成像评估其染色特性，并借助NFAT-荧光素酶报告系统定量检测CAR激活强度。所有实验均设置严格的阴性对照，健康供者外周血单核细胞（PBMC）来源经伦理委员会批准。

优化抗原多聚体在CAR表达细胞系中的应用

通过滴定实验发现，当每个葡聚糖骨架连接约9个抗原分子时，多聚体对抗CD19 CAR-T细胞的染色指数（SI）达到峰值。

值得注意的是，过高抗原密度（>15个/骨架）反而因空间位阻效应导致信号减弱，而四聚体由于价态限制，其染色强度对抗原数量变化不敏感。

抗原多聚体展现高特异性与准确性

交叉染色实验表明，多聚体对匹配CAR阳性细胞的检出率≥97%，而对非匹配CAR或阴性细胞的染色率<1%。共聚焦显微镜显示，多聚体在细胞表面形成聚集性簇状分布，而四聚体呈均匀分布，这种差异反映了多聚体通过高亲合力诱导CAR聚类的能力。

高亲和力CAR的自发聚类抑制多聚体结合

在检测不同亲和力的抗HER2 CAR（K_d范围10^-7-10^-11 M）时，出人意料地发现最高亲和力CAR的染色强度反而最低。

进一步研究揭示，高亲和力CAR存在抗原非依赖性自发聚类现象，导致表面可及性降低，这为解释临床中高亲和力CAR有时疗效反而不佳的现象提供了分子层面的证据。

多聚体作为CAR-抗原相互作用的功能评估工具

NFAT报告实验证实，多聚体可有效激活CAR信号通路，且中等亲和力CAR（K_d=16 nM）的激活强度显著高于最高亲和力CAR（K_d=0.3 nM）。通过比较不同CAR表达水平的细胞群体，发现低表达条件下高亲和力CAR反而呈现更好的多聚体结合能力，说明自发聚类现象与CAR密度密切相关。

这项研究的创新价值在于突破了传统检测试剂的单一功能局限。葡聚糖多聚体不仅实现了对CAR-T细胞的高灵敏度检测（检测限达0.1%），更通过其模块化设计揭示了CAR亲和力、抗原密度与功能激活之间的复杂关系。特别值得注意的是，该技术能够识别因scFv自身寡聚化导致的抗原非依赖性激活现象，这对预防CAR-T细胞过度激活引起的细胞因子释放综合征（CRS）具有重要预警价值。研究结果还提示，针对实体瘤治疗中正在开发的低亲和力CAR（如靶向CEA的CAR），多聚体技术可通过提高抗原密度补偿结合力不足，为优化CAR设计提供了量化依据。

随着双特异性CAR、逻辑门控CAR等新型设计进入临床探索阶段，这种能够同时评估多种CAR靶点相互作用的检测平台展现出独特优势。未来通过整合共刺激分子或细胞因子，多聚体技术有望发展为兼具检测、扩增、功能调控等多重功能的一体化工具，推动CAR-T疗法从血液肿瘤向实体瘤、自身免疫病等更广阔领域拓展。该研究发表于《Cancer Immunology, Immunotherapy》，为免疫细胞治疗的质量控制提供了新的技术标准。