ParaRef：去污染寄生虫参考数据库提升古今宏基因组检测准确性

《Genome Biology》：ParaRef: a decontaminated reference database for parasite detection in ancient and modern metagenomic datasets

本研究针对公共参考基因组中普遍存在的污染问题，系统性地去除了831种寄生虫基因组中的污染序列，构建了去污染参考数据库ParaRef。通过模拟和真实数据验证，该数据库显著降低了寄生虫检测的假阳性率，同时保持高灵敏度，为临床、考古和生态学研究提供了可靠的寄生虫检测资源。

　　

在人类历史长河中，寄生虫始终是健康的隐形威胁。从史前狩猎采集者到中世纪城镇居民，寄生虫感染不仅造成个体病痛，更深刻影响着社会卫生状况与饮食习惯。传统寄生虫检测依赖显微镜观察或特定基因PCR扩增，但这些方法难以实现精准物种鉴定，尤其对形态相似或微量残留的寄生虫束手无策。随着宏基因组测序技术的普及，研究人员得以从粪便、沉积物甚至古生物样本中直接检测寄生虫DNA，但这项技术的准确性却受制于一个隐藏的“陷阱”——公共参考基因组中广泛存在的污染序列。

这些污染如何产生？在基因组测序过程中，来自宿主组织、环境微生物甚至实验试剂的DNA可能被错误整合到寄生虫基因组组装中。当研究人员将测序数据与污染基因组比对时，寄生虫DNA可能被误判，而污染源DNA（如人类或细菌序列）也可能被错误归类为寄生虫信号。更棘手的是，在古代DNA研究中，污染序列本身可能携带典型的古DNA损伤特征（如胞嘧啶脱氨基），使得假阳性结果更难被识别。

为破解这一难题，哥本哈根大学的研究团队对831个已发表的寄生虫基因组展开系统性筛查，构建了去污染参考数据库ParaRef。研究发现，超过98%的寄生虫基因组存在污染序列，其中细菌源性污染占比高达86%，宿主DNA污染占8.4%。极端案例中，某种线虫基因组竟完全由布鲁氏菌序列构成。污染程度与基因组组装质量密切相关：仅17%的染色体级别基因组存在污染，而 scaffold 级别基因组的污染比例超过50%。

研究团队采用FCS-GX和Conterminator两种工具进行去污染。FCS-GX基于NCB I参考库快速识别外源序列，而Conterminator通过跨物种序列比对提供互补检测。去污染后的数据库在模拟实验中展现出显著优势：假阳性比对从平均3.8万次降至200次，精确度从7.9%提升至94.3%，而对真实寄生虫序列的检测灵敏度保持95%以上。

在真实数据验证中，研究重新分析了14组古今宏基因组数据，包括古盐矿粪便、哈扎猎人粪便和现代养殖场样本。使用原始数据库时，79%的寄生虫信号（涉及310万次比对）因覆盖度不均被判定为假阳性；而ParaRef将这些假阳性削减97%，同时揭示出多个先前被掩盖的真实感染案例，如中世纪样本中的蛔虫、哈扎人群中的血吸虫，以及狗粪便中的钩虫。

关键技术方法包括：使用FCS-GX和Conterminator进行基因组污染筛查与去除；通过 gargammel 模拟含寄生虫DNA的宏基因组数据；采用 KrakenUniq 进行 k-mer 分类与 Bowtie2 比对验证；利用覆盖度熵值（covPosRelEntropy1000）评估比对均匀性；对古数据额外分析编辑距离分布和脱氨基模式。样本来源涵盖考古遗址（如哈尔施塔特盐矿）、现代人群（坦桑尼亚哈扎人）和养殖场（欧洲屠宰场猪群）。

污染程度与来源分析

通过系统筛查发现，短 contig（<100 kb）携带了75%的污染序列，且2018年后提交的基因组污染比例虽有所下降，但污染绝对数量持续增加。污染主要源于宿主体内微生物（如线虫共生菌 Stenotrophomonas indicatrix）、宿主组织（如猪DNA在猪带绦虫基因组中）以及实验试剂中的背景DNA。

污染导致的误判机制

污染序列会引发“链式误判”：当样本中含有与污染源同源的DNA（如人粪便中的人类DNA或细菌序列），这些序列会优先比对至寄生虫基因组的污染区域，并因符合编辑距离衰减或古DNA损伤模式而通过常规验证。

去污染效果评估

在模拟实验中，去污染数据库使 Trichuris trichiura 等高风险寄生虫的假阳性信号下降30-100倍。唯一例外是阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis），因基因组高重复序列特性导致40%的真序列丢失，提示需针对特殊基因组优化去污策略。

实际应用验证

古DNA样本中，去污染将哈尔施塔特粪便样本中 T. trichiura 的“不均匀覆盖”信号转化为均匀分布，与线粒体基因组证据相互印证。现代临床样本中，去污染消除了猪粪便数据中因猪DNA污染导致的猪带绦虫假阳性，同时检出真实感染的苏氏蛔虫（Ascaris suum）和齿结节线虫（Oesophagostomum dentatum）。

讨论与展望

研究指出，尽管长读长测序技术提升了基因组组装质量，但公共数据库污染问题仍未缓解。ParaRef 的优势在于其普适性：不论使用 k-mer 分类还是比对流程，去污染均能降低假阳性。团队建议用户结合覆盖度熵值、编辑距离分布等指标进行验证，并对古DNA增加片段长度与损伤模式分析。

该研究不仅为寄生虫检测提供了可靠工具，更警示学界：参考数据库质量是宏基因组研究的基石。未来需建立动态更新机制，将去污染流程纳入基因组提交标准，从而推动病原检测在公共卫生、进化研究和考古学中的更精准应用。