USP21/YBX1/HIF1-α轴通过去泛素化调控机制促进前列腺癌恶性进展

《Journal of Translational Medicine》：USP21/YBX1/HIF1-α promotes the progression of prostate cancer

本研究针对前列腺癌(PCa)进展机制不明的临床难题，首次系统阐明了去泛素化酶USP21通过稳定YBX1蛋白、激活HIF1-α转录的分子通路。研究人员发现USP21在PCa中显著高表达且与不良预后相关，机制上证实USP21特异性去除YBX1的K48连接多聚泛素链，进而促进HIF1-α转录活化，最终驱动肿瘤恶性表型。值得注意的是，小分子抑制剂Bay-805通过靶向USP21/YBX1/HIF1-α轴显著抑制PCa进展，为临床治疗提供了新策略。

　　

前列腺癌作为全球男性第二高发的恶性肿瘤，近年来晚期诊断病例比例持续上升，其中去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的治疗困境尤为突出。尽管雄激素剥夺疗法是转移性前列腺癌的基石方案，但多数患者会在18-24个月内产生耐药性，导致临床预后急剧恶化。在这一背景下，探索新的分子机制和治疗靶点显得尤为重要。

蛋白质翻译后修饰，特别是可逆的泛素化和去泛素化过程，在肿瘤发生发展中扮演着关键角色。去泛素化酶USP21作为高度保守的蛋白酶，已被证实在多种恶性肿瘤中发挥致癌作用，但其在前列腺癌中的具体功能和分子机制尚未明确。与此同时，转录因子YBX1在前列腺癌中异常高表达且与不良预后相关，而低氧诱导因子HIF1-α信号通路在肿瘤适应低氧环境、血管生成等过程中起核心作用，三者之间可能存在的调控网络为理解前列腺癌进展提供了新的视角。

发表于《Journal of Translational Medicine》的这项研究首次系统揭示了USP21/YBX1/HIF1-α轴在前列腺癌恶性进展中的关键作用。研究人员通过多组学分析结合实验验证，发现USP21通过去泛素化作用稳定YBX1蛋白，进而转录激活HIF1-α表达，最终促进肿瘤增殖和转移。更引人注目的是，研究团队证实USP21靶向抑制剂Bay-805能有效阻断该信号轴，展现出显著的治疗潜力。

关键技术方法包括：利用TCGA和GEO数据库进行生物信息学分析；组织微阵列免疫组化、Western blotting和RT-qPCR检测临床样本；患者来源类器官(PDO)模型构建；免疫共沉淀-质谱联用(Co-IP/MS)筛选互作蛋白；双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀(ChIP)验证转录调控；体内外功能实验验证恶性表型。

USP21在前列腺癌中上调并与不良预后相关

通过TCGA-PRAD队列分析发现USP21表达与患者总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)显著相关。临床病理分析显示，USP21高表达与更高的Gleason评分、晚期T分期和生化复发率增加密切相关。GEO数据集(GSE3225、GSE29079)和临床标本验证均证实USP21在mRNA和蛋白水平的癌症特异性高表达。组织微阵列免疫组化显示USP21表达强度与Gleason评分呈正相关，且高USP21表达与生化复发风险增加和PFS降低相关。

USP21促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

功能实验表明，敲低USP21显著抑制PCa细胞增殖能力，而过表达则增强增殖。划痕愈合实验显示USP21敲低延缓创口闭合，而过表达加速修复。Transwell实验和3D Matrigel侵袭实验均证实USP21正调控PCa细胞迁移和侵袭能力。

USP21在体内调控前列腺癌进展

皮下移植瘤模型显示USP21敲低显著抑制肿瘤体积和重量，而过表达促进肿瘤生长。肺转移模型中，USP21敲低组荧光信号强度显著降低，而过表达组增强。组织学检查证实敲低组转移结节减少，而过表达组增多。患者来源PCa类器官中USP21敲低同样抑制增殖和生长。

USP21与YBX1相互作用

Co-IP联合质谱分析鉴定YBX1为USP21关键结合蛋白。免疫荧光显示USP21与YBX1在PCa细胞中存在明显空间重叠，Pearson相关系数在DU145细胞中为0.82，PC3细胞中为0.76。外源和内源Co-IP实验均验证两者相互作用，并确定USP21的C末端USP结构域为关键结合区域。USP21敲低降低而过表达增加YBX1蛋白水平，但不影响其mRNA表达。

±SD (n=3), and p value was determined using Student's t-test. {}^{*} p<0.05,{}^{**} p<0.01,{}^{***} p<0.001'>

USP21去泛素化并稳定YBX1

过表达USP21野生型而非催化失活突变体C211A可增加YBX1蛋白水平。环己酰亚胺(CHX)追踪实验显示USP21敲低加速YBX1蛋白降解，而过表达延长其半衰期。MG132处理抑制YBX1降解，证实其依赖泛素-蛋白酶体系统(UPS)。USP21敲低增加而过表达减少YBX1泛素化，且USP21特异性切割K48连接多聚泛素链。K48R泛素突变体表达可挽救USP21敲低诱导的YBX1蛋白水平降低。

p<0.05,p<0.01,p<0.001'>

YBX1转录激活HIF1-α

转录组测序发现USP21敲低后HIF1信号通路显著富集。TCGA PRAD数据分析显示YBX1与HIF1A表达呈正相关。JASPAR数据库预测YBX1在HIF1A启动子区的结合位点，双荧光素酶报告基因和ChIP-qPCR验证YBX1直接结合HIF1A启动子。YBX1敲低或过表达相应下调或上调HIF1A mRNA水平，且YBX1过表达可部分挽救USP21敲低诱导的HIF1-α表达抑制。功能挽救实验证实YBX1过表达挽救USP21敲低诱导的细胞增殖和侵袭抑制。

1.(C) KEGG pathway enrichment analysis of RNA sequencing differentially expressed genes revealed the top 15 functional annotations.(D) correlation analysis between YBX1 and HIF1A mRNA level based on TCGA PRAD cohort dataset.(R=0.43,p=1.16x10-20)(E) JASPAR database analysis identifies the binding sites between YBX1 and HIF1A.(F) the schematic diagram of wild-type(WT) and mutant(mut) HIF1A promoter plasmid constructs.(G) dual-luciferase reporter assays were used to assess the effect of YBX1 on the fluorescence of both HIF1A-WT and HIF1A-Mut.(H) ChIP assays were carried out in DU145 and PC3 cells. IgG was used as a negative control for ChIP.The Fold enrichment values of RT-qPCR were normalized to the input.(I)RT-qPCR was used to quantify changes in HIF1A mRNA expression following the knockdown(si-YBX1 sequence: 5'-GGAGUUUGAUGUUGUUGAAGG-3')and overexpression of YBX1.(J) RT-qPCR was used to quantify changes in HIF1A mRNA in the sh-NC, sh-USP21 and sh-USP21+YBX1 groups.(K) Western blot was used to detect changes in HIF1-a in the sh-NC, sh-USP21 and sh-USP21+YBX1 groups, followed by statistical analysis.(L-M) colony formation assays were conducted in DU145 and PC3 cells to assess cell proliferation in the sh-NC, sh-USP21 and sh-USP21+YBX1 groups, followed by statistical analysis.(N-O) 3D matrigel invasion assays were conducted in DU145 and PC3 cells to evaluate cell invasion in the sh-NC, sh-USP21 and sh-USP21+YBX1 groups, followed by statistical analysis. Scale bar=200μm. Data were presented as means±SD(n=3), and p value was determined using Student's t-test.p<0.05,p<0.01,p<0.001'>

BAY-805通过抑制USP21/YBX1/HIF1-α轴抑制前列腺癌进展

分子对接证实Bay-805与USP21稳定结合。Bay-805剂量依赖性抑制PCa细胞增殖、迁移和侵袭能力，且USP21过表达减弱Bay-805的抗增殖效应。Western blot显示Bay-805剂量依赖性抑制USP21、YBX1和HIF1-α表达，且该效应可被USP21过表达逆转。体内实验证实Bay-805处理显著降低移植瘤重量和体积，IHC显示USP21、YBX1、HIF1-α和Ki-67表达降低。

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本研究系统阐明了USP21/YBX1/HIF1-α轴在前列腺癌进展中的关键作用。USP21通过特异性去除YBX1的K48连接多聚泛素链而稳定YBX1蛋白，进而促进HIF1-α转录活化，最终驱动肿瘤恶性表型。这一发现不仅揭示了去泛素化酶在前列腺癌中的新功能，更重要的是为临床治疗提供了新的靶点。小分子抑制剂Bay-805通过靶向该信号轴显著抑制肿瘤进展，展现出良好的转化应用前景。

该研究的创新性在于首次将USP21、YBX1和HIF1-α三个关键分子串联成完整的信号通路，从去泛素化修饰、转录调控到功能表型形成了完整的证据链。值得注意的是，研究团队采用了多层次的验证体系，从临床样本分析到分子机制探索，从体外细胞模型到体内动物实验，再到患者来源类器官模型，构建了完整的论证体系。

对于前列腺癌治疗领域，这项研究的意义尤为突出。去势抵抗性前列腺癌的治疗一直是临床难点，USP21/YBX1/HIF1-α轴的发现为克服治疗耐药提供了新思路。特别是Bay-805的成功验证，为开发针对该通路的新型靶向药物奠定了坚实基础。未来研究可进一步探索该通路在不同前列腺癌亚型中的特异性作用，以及与其他信号通路的交叉对话，为个性化治疗提供更多理论依据。