综述：CAR-T和CAR-NK细胞疗法在急性髓系白血病中的应用：突破障碍与展望未来

《Journal of Translational Medicine》：CAR-T and CAR-NK cell therapies in AML: breaking barriers and charting the future

本综述系统阐述了嵌合抗原受体（CAR）工程化T细胞与自然杀伤（NK）细胞疗法在治疗难治/复发性急性髓系白血病（AML）中的最新进展。文章重点分析了靶向CD123、CD33等关键抗原的临床前突破与临床试验成果（完全缓解率高达66%），并深入探讨了如何通过双靶向CAR、细胞因子装甲结构、CRISPR基因编辑等创新策略克服抗原逃逸、免疫抑制微环境（包括瘤内微生物群变异）及肿瘤靶向/脱瘤毒性等挑战。综述进一步展望了结合检查点抑制剂、代谢调节剂及人工智能（AI）驱动抗原选择等新兴策略的未来方向，为将细胞免疫疗法转化为AML的基石治疗方案提供了权威见解。

　　

CAR-T和CAR-NK细胞疗法在AML中的应用：突破障碍与展望未来

引言

急性髓系白血病（AML）是成人中最常见的急性白血病，尽管治疗手段不断进步，但其高复发率和低于30%的5年生存率，尤其是对于难治/复发性（R/R）患者，仍然构成严峻的临床挑战。传统的强化化疗和异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）往往无法根除驱动化疗耐药和疾病复发的白血病干细胞（LSCs）。虽然FLT3、IDH抑制剂等分子靶向药物扩大了治疗选择，但其适用性限于特定基因亚型，许多患者仍缺乏持久应答。这种未满足的临床需求催生了创新免疫疗法的发展，特别是嵌合抗原受体（CAR）工程化的T细胞和自然杀伤（NK）细胞，它们有望重新定义AML的治疗格局。

CAR-T细胞在AML中的应用

CAR-T细胞代表了癌症免疫疗法的突破性进展。其结构包含三个功能域：用于抗原识别的胞外域（通常是源自抗体的单链可变片段，scFv）、用于锚定在膜上的跨膜域、以及包含用于初始T细胞激活的CD3ζ链和共刺激域（如CD28或4-1BB）的胞内信号域。这种设计使得CAR-T细胞在遇到肿瘤细胞时能够有效激活和增殖。

将CAR-T细胞疗法应用于AML的一个主要挑战在于寻找合适的靶抗原。与B细胞恶性肿瘤拥有CD19这类耐受性良好的靶点不同，AML细胞表达的抗原通常也存在于健康的造血干细胞上，这引发了关于“靶向/脱瘤”毒性的担忧。因此，开发在保持疗效的同时提高特异性的策略至关重要。最近的进展集中在双靶向方法，例如将靶向CD33（在超过88%的AML病例中表达）的CAR与TIM3（与白血病干细胞相关但与正常造血祖细胞无关）相结合的策略，旨在通过减少对健康组织的附带损伤来改善CAR-T细胞疗法的安全性。

白血病干细胞（LSCs）在AML发病机制中的作用促使研究人员探索专门靶向这些细胞的CAR-T细胞疗法。针对CD33或CD93等特定抗原的CAR-T细胞有望改善AML患者的预后。尽管临床前研究和早期临床试验显示出前景，但AML及其微环境的异质性仍是持续存在的挑战。

CAR-T细胞技术的进展

下一代CAR-T细胞疗法因其在克服某些局限性方面效率提高而取得新进展。肿瘤微环境（TME）中的多种因素，包括免疫抑制细胞群体（如调节性T细胞[T_reg]和髓系来源的抑制性细胞[MDSCs]）的存在，以及抑制性介质（如IL-10和TGF-β）的分泌，均会降低CAR-T细胞的疗效。此外，肿瘤细胞产生的趋化因子与CAR-T细胞上受体的不匹配也导致其无法有效浸润肿瘤区域。

为解决这些限制，研究人员引入了多种方法。例如，TRUCK（介导通用细胞因子杀伤的重定向T细胞）被设计用于分泌一系列促炎细胞因子（如IL-12, IL-15, IL-18, IL-7, IL-23），通过极化TME、增强细胞毒性、抑制T_reg活性等机制增强抗肿瘤效果。在CAR-T细胞中加入CD40配体（CD40L）可通过与树突状细胞（DCs）相互作用促进促炎细胞因子释放，并诱导表达CD40的肿瘤细胞凋亡，从而增强治疗潜力。

PD-1/PD-L1轴在CAR-T细胞耗竭中起关键作用。阻断该轴可显著增强疗效。策略包括使用PD-1显性阴性受体（“陷阱”）、将PD-1胞外域与CD28胞内共刺激域融合的“转换受体”、以及通过基因组编辑敲低PD-1或表达抗PD-1 scFv。

为了提高CAR-T细胞向白血病病灶的归巢能力，使其表达趋化因子受体（如CCR2, CXCR4等）是有效的策略，其中CXCR4对于促进CAR-T细胞浸润至骨髓微环境尤为重要。

基因工程技术（如CRISPR-Cas9或TALEN）的发展推动了对通用型CAR-T细胞的研究。这类同种异体CAR-T细胞通过敲除MHC和TCR基因来预防移植物抗宿主病（GVHD）和宿主排斥反应，相比自体CAR-T细胞具有生产时间短、可规模化等优势，但也面临体内持久性较短等挑战。

为降低CAR-T细胞疗法的细胞因子释放综合征（CRS）和严重神经毒性等风险，引入了“安全开关”策略。例如，在CAR-T细胞表面表达截短的表皮生长因子受体（tEGFR），通过注射西妥昔单抗等抗EGFR抗体，可借助抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）清除这些修饰过的细胞。

抗原逃逸是AML的常见挑战。为此，工程化能够同时靶向两个不同抗原（如CD33和CLL-1，或CLL-1和CD123）的双靶向CAR-T细胞，可显著提高治疗应答并减少抗原逃逸。

CAR-NK疗法在AML中的应用

CAR-NK细胞的机制

CAR-NK细胞整合了CAR-T细胞的抗原特异性靶向能力和NK细胞过继性细胞转移（ACT）的固有活性，建立了一个能够解决AML治疗中诸多限制的平台。NK细胞的功能不依赖于人类白细胞抗原（HLA），且无需预先致敏，其功能取决于多种 germline 编码受体（如NKG2D）产生的激活性和抑制性信号之间的平衡。因此，即使肿瘤出现CAR抗原丢失或下调等逃逸策略，NK细胞仍能通过这些天然受体保持细胞毒性。NK细胞可通过CD16介导的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、穿孔素和颗粒酶等介导的直接细胞毒性、或激活FAS配体（FASL）、TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）等死亡受体来清除恶性细胞。此外，NK细胞高效产生趋化因子和细胞因子的能力在调节细胞毒性中至关重要。因此，引导NK细胞表达CAR可能会提高清除异质性肿瘤群体的疗效，并降低CAR依赖性机制相关的复发风险。

与T细胞相比，CAR-NK疗法不会引起严重的CRS或免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。NK细胞体内寿命较短，以及其在细胞毒性过程中释放的细胞因子和生长因子（如IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-3）的特性，可能是其安全性优势的原因。

当前临床试验与结果

尽管NK细胞方法潜力巨大，但与AML相关的CAR靶抗原范围仍需拓展。CD33是CAR-NK细胞疗法的一个潜在靶点，超过90%的AML患者白血病细胞表面存在该标志物。研究表明，源自外周血NK细胞的CD33-CAR-NK模型在体外和体内均表现出显著的抗AML细胞毒性。儿童AML常伴有CD123高表达，使其成为CAR-NK细胞疗法的有吸引力的靶点。表达4-1BB共刺激域的第二代CD123-CAR-NK细胞显示出比CD123 CAR-T细胞更佳的安全性，同时在体外和体内保留了显著的抗白血病作用。CD38是AML免疫治疗的另一个有前景的靶点。研究显示，敲除CD38并表达亲和力优化的CD38 CAR的CAR-NK细胞，联合全反式维甲酸（ATRA），能显著提高NK细胞对CD38阳性成熟髓系细胞的靶向效率和细胞毒性潜力。

这些临床前发现推动了几项正在进行的临床试验，一些试验已显示出鼓舞人心的初步结果。例如，NKX101（NKG2D-CAR-NK）在AML中的I期随访数据显示，不完全计数恢复的完全缓解（CR/CRi）率高达67%。评估抗CD33 CAR-NK细胞联合氟达拉滨和环磷酰胺的I期临床试验也取得了显著进展，在10例可评估的R/R AML患者中，仅1例出现2级CRS，无高级别CRS或任何级别的ICANS，所有患者均在1个月内从3-4级骨髓抑制中恢复，60%的患者在CAR-NK细胞输注28天后达到CR。这些发现凸显了CAR-NK细胞在“现货”可用性和降低CRS风险方面的潜力。

CAR-NK细胞技术的进展

CAR-NK细胞的出现有效解决了CAR-T细胞疗法的一些缺点。NK细胞具有固有的杀伤肿瘤细胞的能力，且不依赖肿瘤相关抗原识别，因此无需预先抗原致敏，制备时间更短。此外，其细胞因子分泌谱与T细胞不同，降低了细胞因子风暴等不良反应的风险。

然而，CAR-NK细胞的生成和治疗应用仍存在一些限制。与CAR-T细胞类似，大规模生产需要细胞因子或饲养细胞，但存在安全性顾虑。非病毒载体（如电转）和新型慢病毒载体（如BaEV-LV）的应用改善了基因转导效率。

抗原丢失问题在NK细胞疗法中同样存在。双靶向CAR-NK细胞是解决方案之一，但需谨慎选择靶点。多因子工程化（如iPSC来源的NK细胞同时表达CAR、高亲和力不可切割CD16变体[hnCD16]和IL-15/IL-15Rα融合蛋白[IL-15RF]）可显著增强持久性和疗效。为减少对表达相同抗原的非肿瘤组织的毒性，可选择亲和力较低的CAR，使其仅在高表达靶点的肿瘤细胞上被激活。在CAR-NK细胞中植入“自杀开关”（如诱导型 caspase 9）也是提高安全性的创新方法。

为抵抗肿瘤微环境（TME）的抑制作用，可通过基因操作使CAR-NK细胞过表达过氧化还原蛋白-1（PRDX-1）以增强其对TME的适应性。敲除TGF-βRII可增强NK细胞的抗肿瘤效果和稳定性。敲除NKG2A等抑制性受体可解除肿瘤细胞对NK细胞的抑制。组成性表达IL-15或共表达细胞因子受体（如IL-2/15Rβ）可增强CAR-NK细胞的持久性，但需注意高剂量系统性细胞因子给药的毒性风险。用IL-12、IL-15、IL-18短期刺激可诱导NK细胞产生记忆样特性。输注前的清髓预处理方案（如氟达拉滨和环磷酰胺）也有助于提高细胞持久性。

在某些CAR-NK细胞中观察到“同胞相残”现象，这与激活型CAR（aCAR）以及通过 trogocytosis 从靶细胞获取抗原有关。为解决此问题，开发了抑制性CAR（iCAR），在同一NK细胞上同时工程化表达iCAR和aCAR，可防止同胞相残，提高细胞存活率。

挑战与局限

尽管CAR-T和CAR-NK疗法在AML中具有变革潜力，但其广泛应用仍面临关键挑战。主要障碍在于寻找白血病特异性抗原，AML原始细胞和LSCs的表面标记物常与健康造血祖细胞共享，导致“靶向/脱瘤”毒性和骨髓抑制风险。抗原逃逸（白血病细胞下调靶抗原）也是一个持续存在的问题。

免疫抑制性的骨髓微环境是另一个巨大障碍。瘤内微生物群的异质性与AML中免疫抑制微环境的形成相关，可能影响CAR-T/NK功能。MDSCs、T_reg和抑制性细胞因子（如TGF-β, IL-10）创造了抑制CAR细胞活性和促进耗竭的恶劣环境。

CAR-T细胞本身存在体内持久性差、反复抗原刺激后终末分化等局限性。CAR-NK细胞虽不易耗竭，但其较短寿命和有限扩增能力限制了持续抗肿瘤反应。

生产工艺复杂、自体疗法导致的延迟、同种异体“现货”产品的可扩展性挑战以及高昂的成本都是制约因素。

安全性方面，CAR-T疗法CRS和ICANS发生率较高，需密切监测和管理。CAR-NK细胞毒性较轻，但高剂量下的IL-12/IFN-γ驱动神经毒性仍需关注。针对新型双靶向CAR和基因编辑通用细胞的长期安全性数据仍然缺乏。

未来方向

CAR-T和CAR-NK细胞疗法在AML中的快速发展带来了变革性机遇。个性化治疗策略、由多组学分析指导的患者分层、人工智能预测最佳抗原对用于双靶向CAR，有望提高特异性并减少毒性。

下一代CAR设计，如逻辑门控“与/或”系统（仅在两种AML相关抗原共表达时激活），可更好地保护健康细胞。CRISPR-Cas9编辑的“装甲”CAR-T细胞（表达IL-15或显性负性TGF-β受体）可抵抗TME免疫抑制。使CAR-T/NK细胞过表达CXCR4或CCR2等趋化因子受体可改善其向骨髓归巢。

联合疗法将是未来主要临床策略。将CAR-T/NK细胞与免疫检查点（如TIM-3, LILRB4）的小分子抑制剂或代谢调节剂（如IDO抑制剂）联用，可破坏免疫抑制性TME。新兴策略还应靶向微生物群-免疫轴，通过抗生素、益生菌或噬菌体疗法调节瘤内微生物群，可能重编程免疫抑制微环境，增加AML对CAR-T/NK细胞的敏感性。

对于CAR-NK细胞，推进“现货”平台至关重要。源自iPSC、敲除抑制性受体（如NKG2A）或经CRISPR编辑表达CD16变体以增强ADCC的通用型CAR-NK细胞，可标准化生产并提高可扩展性。优化NK细胞冻存技术有助于全球分发。

最后，解决成本和可及性问题需要创新去中心化、自动化生产平台。用于闭环CAR-T生产的微流体系统或用于NK细胞扩增的模块化生物反应器可降低成本、缩短生产时间。学术界与工业界的合作框架，以及针对儿科AML疗法的监管激励，对于普及 access 至关重要。

结论

AML以其侵袭性复发和低生存率为特征，尽管常规疗法有所进展，仍是严峻的临床挑战。CAR工程化的T和NK细胞疗法已成为突破性免疫治疗模式，提供针对LSCs和耐药原始细胞的靶向清除。靶向CD123、CD33、CLL-1等抗原的CAR-T细胞显示出良好的临床疗效，在R/R AML中完全缓解率超过60%。同时，CAR-NK细胞凭借其固有的肿瘤监视能力、较低的毒性和“现货”可行性，作为补充方案，在早期试验中实现了持久反应。双靶向CAR、细胞因子装甲结构、CRISPR编辑的通用细胞等创新有望克服抗原逃逸、免疫抑制微环境和靶向/脱瘤毒性等障碍。

然而，挑战依然存在，包括生产工艺的可扩展性、成本限制和长期安全性问题。富含MDSCs和抑制性细胞因子的免疫抑制性骨髓微环境持续阻碍持久疗效。未来的进步取决于跨学科合作，以整合AI驱动的抗原选择、生物标志物指导的个性化治疗以及与检查点抑制剂或代谢调节剂的联合方案。新兴的“现货”平台，包括iPSC衍生的CAR-NK细胞和自动化生物反应器系统，有望普及 access 并缩短生产时间。

随着该领域的发展，下一代CAR设计、微环境靶向策略和成本效益高的生产平台的协同作用，对于将临床前突破转化为拯救生命的疗法至关重要。通过应对这些挑战，CAR-T和CAR-NK细胞疗法具有变革性潜力，可重新定义AML的治疗，迎来一个即使是最高危患者也能实现持久缓解的精准医疗时代。