单细胞与bulk RNA测序联合分析揭示STAT1通过调控巨噬细胞自噬与铁死亡在类风湿关节炎中的作用机制

《Journal of Translational Medicine》：Integrated analysis of single-cell RNA-seq and bulk RNA-seq reveal macrophage subpopulation characteristics and the role of STAT1 in rheumatoid arthritis

本研究针对类风湿关节炎(RA)中巨噬细胞异质性分子特征不清的问题，通过整合scRNA-seq和bulk RNA-seq数据，结合LASSO回归和随机森林模型筛选出关键基因STAT1，并在佐剂性关节炎(AIA)大鼠模型中验证其通过调控LC3/p62自噬通路和ACSL4/GPX4铁死亡通路促进RA发病的机制，为RA靶向治疗提供新思路。

　　

在自身免疫性疾病领域，类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)一直是一块难啃的硬骨头。这种以慢性滑膜炎和进行性关节破坏为特征的疾病，全球患病率高达0.24%-0.30%，不仅给患者带来终身痛苦，还显著增加心血管疾病和恶性肿瘤的发病风险。在RA复杂的发病机制中，巨噬细胞作为滑膜组织中最重要的免疫细胞，通过分泌炎性因子和降解酶驱动关节炎症，但其异质性和分子调控机制始终是未解之谜。

传统研究大多依赖批量RNA测序(bulk RNA-seq)技术，这种方法虽然能获得组织整体的转录谱，却无法揭示细胞间的异质性。而新兴的单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术恰好能弥补这一缺陷，使研究人员能够在单细胞水平解析免疫细胞的复杂组成和功能状态。《Journal of Translational Medicine》最新发表的一项研究，通过整合两种测序技术，深入揭示了RA中巨噬细胞亚群的特性及其关键调控机制。

为了攻克这一难题，研究团队首先从GEO数据库获取了包括GSE221704和GSE230145在内的scRNA-seq数据集，以及GSE12021等五个bulk RNA-seq数据集，共涵盖213例RA样本和63例健康对照。经过严格的质量控制，26,923个细胞进入后续分析。研究人员采用Seurat软件包进行细胞分群，通过Harmony算法校正批次效应，并利用经典标记基因成功鉴定出16种细胞类型。值得注意的是，RA组中巨噬细胞和成纤维细胞比例显著增加，且巨噬细胞差异表达基因数量达206个，仅次于软骨细胞。

聚焦髓系细胞后，研究团队通过二次聚类将巨噬细胞进一步分为五个亚群：Stat1+巨噬细胞(标记基因Stat1、Tgfbr3)、Fn1+巨噬细胞(Fn1、S100a4、Vcan)、Il7r+巨噬细胞(Il7r、Ccr9、Flt3)、Cd14+单核细胞(Cd14)和C1q+巨噬细胞(C1qa、C1qc、C1qb)。细胞比例分析显示，RA小鼠中Stat1+巨噬细胞和Cd14+单核细胞显著增多，而其他亚群比例下降。功能富集分析表明，Stat1+巨噬细胞标志基因显著富集在铁死亡(ferroptosis)、自噬(autophagy)和细胞周期等通路。进一步分析发现，RA组Stat1+巨噬细胞中抗原加工呈递和RNA剪接通路显著激活。

伪时序分析描绘了髓系细胞从单核细胞向多个巨噬细胞亚群分化的轨迹，Stat1+巨噬细胞位于分化末端，提示其终末分化状态。基因模块分析显示，该亚群在"细胞对铁离子的反应"等通路显著富集。细胞通讯分析则揭示，RA小鼠中Stat1+巨噬细胞与其他细胞的相互作用显著增强，特别是ITGAL-ITGB2信号轴中的Itgb2-Icam1配体-受体对。

在bulk RNA-seq分析中，研究人员通过差异表达分析筛选出1,434个RA上调基因，与Stat1+巨噬细胞标志基因取交集获得65个候选基因。LASSO回归进一步筛选出30个关键基因，经Boruta和随机森林模型验证，最终确定STAT1等9个基因为核心分子。相关性分析显示STAT1表达与铁死亡(ρ=0.402)、自噬(ρ=0.246)和炎症(ρ=0.435)评分显著相关。

为验证STAT1的功能，研究团队构建了AIA大鼠模型，并采用STAT1抑制剂fludarabine(Flu)进行干预。结果显示，与对照组相比，模型组大鼠出现明显关节肿胀，关节炎指数和足爪体积显著增加，滑膜组织病理评分升高。Flu治疗有效缓解了这些症状。分子水平上，模型组STAT1、LC3-II/LC3-I比值和ACSL4表达上调，p62和GPX4表达下调，而Flu处理逆转了这些变化。

主要技术方法

研究整合了公共数据库中的scRNA-seq和bulk RNA-seq数据，采用Seurat和Harmony进行单细胞数据整合与聚类，通过Monocle3进行伪时序分析，CellChat解析细胞间通讯，结合LASSO回归和随机森林算法筛选关键基因，并利用AIA大鼠模型进行体内功能验证。

单细胞转录图谱揭示RA小鼠免疫细胞特征

通过对26,923个细胞的单细胞转录组分析，研究人员成功鉴定出16种细胞类型。UMAP可视化显示RA组中成纤维细胞和巨噬细胞的空间分布发生显著改变，细胞比例分析证实这两种细胞在RA组中显著增多。差异表达基因分析显示巨噬细胞具有206个DEGs，凸显其在RA中的重要作用。

髓系细胞亚型特征分析

研究人员从单细胞数据中提取出1,432个单核-巨噬细胞进行深入分析，通过无监督聚类识别出五个功能各异的亚群。t-SNE可视化显示RA小鼠巨噬细胞亚群分布模式发生显著改变，其中Stat1+巨噬细胞比例增加最为显著。FeaturePlot进一步验证了各亚群标记基因的表达特异性。

巨噬细胞相关通路差异富集分析

火山图展示了各巨噬细胞亚群的差异表达基因分布。GO和KEGG富集分析表明Stat1+巨噬细胞标志基因显著富集于铁死亡、自噬和细胞周期等通路。GO生物过程分析显示这些基因在巨自噬、细胞组分分解和脂质分解代谢等过程中显著富集。RA组与对照组Stat1+巨噬细胞的差异基因分析显示抗原加工呈递和RNA剪接等通路显著激活。

巨噬细胞伪时序分析

UMAP降维可视化展示了不同巨噬细胞亚群的分布模式。伪时序分析揭示了髓系细胞的分化轨迹，显示健康与RA小鼠细胞群在UMAP空间中分布存在显著差异。伪时序基因热图显示在髓系细胞分化过程中不同通路依次激活，Stat1+巨噬细胞簇在铁相关过程中活性显著增加。

巨噬细胞相关细胞间相互作用分析

CellChat分析揭示了RA小鼠中细胞间通讯的显著增强。细胞相互作用网络显示Stat1+巨噬细胞与其他细胞类型的连接数量和作用强度均增加。差异分析识别出ITGAL-ITGB2等配体-受体对在RA小鼠中特异性上调。进一步分析发现Stat1+巨噬细胞与成纤维细胞仅通过Itgb2-Icam1配体-受体对产生显著差异相互作用。贡献度分析表明Itgb2-Icam1在ITGAL-ITGB2相互作用轴中贡献最高。

基于bulk RNA-seq验证STAT1在RA中的作用

通过limma包进行差异表达分析，研究人员识别出1,434个在RA患者中显著上调的基因。这些基因与Stat1+巨噬细胞标志基因取交集获得65个重叠基因。LASSO回归筛选出30个RA相关关键基因，经Boruta模型评估确定STAT1等9个基因具有最高重要性。随机森林分析进一步验证了STAT1的重要性，相关性分析显示其表达与铁死亡、自噬和炎症通路评分显著相关。

AIA大鼠模型中验证STAT1对自噬和铁死亡通路的影响

通过AIA大鼠模型的功能验证表明，与对照组相比，模型组大鼠出现明显足爪肿胀，关节炎指数评分显著升高。组织病理学评估显示模型组滑膜细胞增生、结缔组织增生和炎性细胞浸润等典型RA病理改变。Flu治疗显著改善了这些症状。免疫组化、qRT-PCR和Western blot结果一致表明STAT1激活上调了滑膜LC3和ACSL4表达，同时下调p62和GPX4，而Flu处理逆转了这些变化。

本研究通过多组学整合分析首次系统揭示了RA滑膜组织中巨噬细胞的异质性特征，特别是Stat1+巨噬细胞亚群在疾病发生发展中的核心作用。研究发现不仅证实了STAT1在RA中的高表达，还深入阐明了其通过调控自噬和铁死亡通路促进疾病进展的分子机制。伪时序分析描绘了髓系细胞在RA炎症微环境中的动态演变过程，而细胞通讯分析则揭示了Stat1+巨噬细胞与其他细胞类型的复杂相互作用网络。

这些发现为理解RA的免疫病理机制提供了新的视角，STAT1及其下游信号通路可能成为RA治疗的潜在靶点。特别是STAT1调控的自噬和铁死亡通路，为开发针对巨噬细胞功能异常的靶向疗法提供了理论依据。该研究的创新之处在于将单细胞测序技术与传统生物学验证相结合，从细胞异质性角度深入解析了RA的复杂发病机制，为未来个体化治疗策略的制定奠定了重要基础。