犬与人肝细胞癌肿瘤微环境的跨物种多组学比较研究揭示保守的分子特征与治疗靶点

《Veterinary Oncology》：Comparative multi-omics evaluation of the tumor microenvironment in dog and human hepatocellular carcinoma

本研究针对肝细胞癌(HCC)治疗抵抗机制不清的问题，通过首次对犬HCC进行全外显子测序(WES)和单核RNA测序(snRNA-seq)多组学分析，发现犬HCC存在与人类高度保守的CTNNB1基因突变谱和肿瘤微环境(TME)细胞组成，特别是巨噬细胞功能特征的相似性，为利用犬自发性HCC模型推进人类肝癌免疫治疗研究提供了重要依据。

　　

肝细胞癌(HCC)作为人类最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，全球年发病数预计将于2025年突破100万例。尽管免疫检查点抑制剂如atezolizumab联合bevacizumab等方案在一定程度上改善了患者生存，但复杂的肿瘤微环境(TME)和治疗抵抗仍是导致预后不良的主要挑战。尤其令人困惑的是，调控免疫抵抗和逃逸的分子机制至今尚未完全阐明。

与人类HCC通常与病毒感染、肝硬化或饮酒相关不同，犬类HCC的发生往往缺乏这些风险因素，为研究疾病内在遗传驱动因素提供了独特视角。更重要的是，犬类癌症具有自发发生、免疫系统完整、肿瘤-免疫相互作用自然演化等特点，比诱导性小鼠模型更能真实模拟人类疾病复杂性。犬HCC作为该物种最常见的原发性肝脏肿瘤，与人类HCC共享关键组织学和分子特征，如TP53、CTNNB1和ARID1A基因的频繁突变，以及Wnt/β-连环蛋白和DNA修复通路的改变。

尽管犬HCC大规模型通常生长缓慢、转移性较低，但手术切除后的系统治疗选择有限，尤其是免疫治疗领域亟待拓展。在此背景下，Nussbaum等研究人员在《Veterinary Oncology》上发表了题为"Comparative multi-omics evaluation of the tumor microenvironment in dog and human hepatocellular carcinoma"的研究，通过整合多组学方法首次深入解析了犬HCC的遗传特征和细胞生态系统。

研究团队收集了10只确诊HCC犬的肿瘤组织和匹配血液样本，从中筛选2例进行深入分析。关键技术方法包括：全外显子测序(WES)检测体细胞突变，使用Twist Alliance Canine Exome捕获 panel进行杂交捕获，GATK Mutect2流程进行变异检测；单核RNA测序(snRNA-seq)分析肿瘤微环境细胞组成，采用10x Genomics Chromium系统建库，Seurat V4.2.0包进行数据整合和细胞聚类；运用CellPhoneDB推断细胞间通讯网络；通过scVI工具整合跨物种单细胞数据进行比较分析。

样本生物样本库建立与处理

所有犬肝脏肿瘤样本均经兽医病理学家确诊为HCC，表现为膨胀性、局部浸润性肿块，由大型肿瘤性肝细胞组成细胞片层。肿瘤内常见多灶性融合凝固性坏死区域，肿瘤细胞呈现轻度至中度核大小不均和细胞大小不均。

外显子测序

对10对HCC肿瘤和匹配正常血液样本进行WES，测序错误率平均为0.35%，测序深度达到100×，93.7%至95.2%的读数成功比对到大参考基因组。

HCC体细胞突变发现

共鉴定出1,895个非同义单核苷酸变异(SNV)，平均每个样本189个突变。其中645个突变具有高、中或低影响VEP评分。最常见的复发错义突变发生在CTNNB1基因，存在于5个(50%)样本中，与人类HCC中该基因22%的突变频率相呼应。

CTNNB1突变位点分析显示犬与人类之间存在显著相似性，相同的D32Y、G34V和S37F氨基酸替换在两个物种中均有发现。DGIdb 5.0数据库检索显示CTNNB1与16种FDA批准疗法存在66种相互作用，提示潜在治疗选择。

肿瘤突变负荷

犬HCC队列的中位TMB为4.01个突变/Mb(范围：2.31-5.96突变/Mb)，与人类HCC估计的中位TMB范围2.56至5个突变/Mb相似。

犬HCC细胞类型注释

snRNA-seq分析共获得23,877个核，平均每个核检测到1,659个读数。通过聚类和手动注释，鉴定出七种主要细胞类型：成纤维细胞、肝细胞、巨噬细胞、恶性细胞、髓系来源的增殖细胞、内皮细胞和T细胞。

恶性细胞通过差异表达分析鉴定，显示CP、APOB、DST和PTGR1等基因过表达，这些基因在人类HCC scRNA-seq研究中也有报道。癌症干性评分分析显示，恶性细胞比肝细胞具有显著更高的癌症干性评分。在两个样本中，正常肝细胞占大多数核，其次是内皮细胞和T细胞。髓系增殖细胞和恶性细胞表现出显著更高的S和G2M期模块评分。

人类和犬snRNA-seq数据集的比较

整合犬和人类HCC snRNA-seq数据显示，非上皮细胞(如T细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞)在两个物种间形成共享簇，而上皮细胞则保持较强的物种特异性。犬恶性细胞和增殖细胞未与人类上皮细胞整合，表明存在显著的物种特异性。

基因表达特征比较显示，人类和犬HCC细胞类型共享高度一致的基因特征。巨噬细胞标志物如MARCO和CD163在两个物种中均富集，T细胞中最保守的基因特征包括细胞表面标志物CD96以及细胞内蛋白SKAP1、SCML4、THEMIS、ITK、CAMK4和FYN。内皮细胞标志物如PTPRB、STAB2、STOX2和F8在物种间保守，而成纤维细胞的共享标志物包括PTH1R、COL6A3和COL1A2。

HCC细胞间通讯分析

CellPhoneDB分析揭示，犬和人类HCC分别存在222和227个配体-受体对。在犬样本的七种主要细胞类型中，鉴定出36个显著信号通路的相关性。成纤维细胞、内皮细胞和恶性细胞在犬中表现出最强的相互作用，而在人类HCC中，恶性细胞参与度更高，涉及ADGRE、ADGRL、Chemerin、CNTN、CypA、GAS、LIGHT和NCAM等通路。

物种特异性相互作用分析发现，犬HCC中独特存在IL34-CSF1R和LGALS9-P4HB相互作用，而人类特异性相互作用包括Chemerin-CMKLR1和GAS6-TAM家族受体(Tyro3、Axl和MerTK)。共享相互作用主要集中在恶性细胞与成纤维细胞(如IGF1-IGF1R、ANGPT1-TEK、JAG1-NOTCH2、THBS1/THBS2-CD36和APP-SORL)以及巨噬细胞与恶性细胞(如PTPRC-MRC1、THBS1-CD36和APP-CD74)之间。

研究结论与讨论部分强调，通过整合WES和snRNA-seq分析，首次提供了犬HCC分子和细胞特征的比较见解。CTNNB1基因在50%犬样本中的复发突变与人类HCC中最常突变基因之一相呼应，表明两个物种间存在相似的致癌机制。尽管犬队列规模相对较小，但CTNNB1突变的共享存在提示犬和人类HCC之间存在相似的致癌机制。

肿瘤微环境的比较分析显示，免疫和基质细胞类型在人类和犬之间具有可比性的转录程序，这种保守性可能反映了免疫监视和基质维持的共同进化压力。然而，恶性和上皮细胞群体表现出更明显的物种特异性差异，可能由组织稳态、再生能力、突变景观和肿瘤进化轨迹的变异驱动。

细胞间通讯分析揭示了两个物种间共享的配体-受体相互作用，反映了已知的肿瘤进展驱动因素，如与癌症干性、血管生成和免疫逃逸相关的IGF1-IGF1R、ANGPT1-TEK、JAG1-NOTCH和Thrombospondin-1-CD36。物种特异性相互作用，如犬中的IL34-CSF1R和LGALS9-P4HB，以及人类中的Chemerin-CMKLR1和GAS6-MerTK/Axl，为治疗靶点发现提供了新线索。

该研究的局限性包括单核评估的技术限制对细胞景观解释的影响，犬snRNA-seq数据集中的拷贝数变异(CNV)推断受分辨率低、高丢失率以及缺乏高质量正常肝脏参考的限制，这可能有助于观察到的恶性和肝细胞簇之间的聚类接近性，限制了一些恶性细胞生物学的普适性。

尽管具有初步性质，但这项研究代表了犬HCC潜在遗传驱动因素的首次整合分析，同时增进了我们对TME的理解，并为其分子和细胞特征提供了基础见解。这些发现为未来在更大犬队列中进行多组学研究奠定了基础，并为比较肿瘤学提供了宝贵资源。研究结果支持跨物种假说生成，可为治疗靶点识别提供信息，以在犬类中进行测试，并提供与人类和兽医肝癌研究相关的耐药机制见解。