无刺蜂产品来源益生乳酸菌的分离鉴定及低聚半乳糖强化微胶囊技术提升其稳定性研究

《Annals of Microbiology》：Probiotic lactic acid bacteria from stingless bee products: isolation, characterization, and enhanced viability using prebiotic-fortified microencapsulation

本研究针对益生菌在加工储存和胃肠道环境中存活率低的关键问题，开展了从无刺蜂蜂蜜和蜂粮中筛选具有优良益生特性的乳酸菌，并利用藻酸盐-壳聚糖双层微胶囊包埋技术结合低聚半乳糖预益生元，显著提升了多菌株益生菌的胃肠道耐受性和长期储存稳定性，为开发新型功能性益生菌制剂提供了稳定高效的技术方案。

　　

在追求健康的今天，益生菌作为活的微生物，当其摄入足够量时能赋予宿主健康益处，已成为功能性食品和膳食补充剂领域的热门研究方向。然而，如何确保这些娇贵的益生菌能够经受住胃酸的猛烈攻击、胆汁盐的严峻考验，并在储存期间保持足够的活菌数，一直是制约其广泛应用的技术瓶颈。传统的益生菌来源多集中于发酵食品，但自然界中是否隐藏着更具潜力的菌种资源？无刺蜂（Stingless bee），这类重要的传粉昆虫，其制造的蜂蜜和蜂粮不仅富含独特的生物活性成分，还是一个尚未被充分探索的益生乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）宝库。这些产品中的天然微生物群落，在与蜜蜂共生的过程中，可能已经演化出卓越的环境适应性和益生功能。因此，从无刺蜂产品中挖掘新型益生菌，并利用先进的保护技术提升其稳定性，对于开发下一代高效、稳定的益生菌产品具有重要的科学意义和应用前景。本研究由Petcharat Ponpichai等人完成，并发表在《Annals of Microbiology》上。

为开展本研究，作者主要应用了以下几个关键技术方法：首先从五种无刺蜂物种的蜂蜜和蜂粮样本中分离乳酸菌，并通过耐酸（pH 3.0）、耐胆盐（0.3%，pH 8.0）等体外模型筛选潜在益生菌。随后评估菌株的细胞表面特性（疏水性、自聚集和共聚集能力）及其对常见食源性病原菌的抗菌活性。安全性通过溶血试验和抗生素敏感性测试进行评估。核心技术创新点在于采用藻酸钠-壳聚糖双层微胶囊包埋系统，并辅以不同浓度的低聚半乳糖（Galacto-oligosaccharides, GOS）作为预益生元，以增强益生菌在模拟胃肠道条件和4°C长期储存下的存活率。菌株通过16S rDNA测序进行分子鉴定。

筛选益生特性

研究人员从无刺蜂蜂蜜和蜂粮中成功分离出34株乳酸菌分离株。通过严格的体外筛选，发现其中三株菌——Lactiplantibacillus sp. SBB-HI4（最接近L. plantarum）、Lactiplantibacillus sp. SBB-HI8（最接近L. pentosus）和Lacticaseibacillus sp. SBB-GT4（最接近L. paracasei）——表现出优异的益生潜力。它们在模拟胃酸（pH 3.0）和胆汁盐（pH 8.0）环境中处理3小时和6小时后，存活率均超过80%，显示出强大的胃肠道耐受性。在细胞表面特性方面，SBB-HI4菌株表现最为突出，其细胞表面疏水性达到34.03%，自聚集能力为20.70%，与大肠杆菌（Escherichia coli）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的共聚集能力分别达到23.92%和19.46%，这些特性预示着其良好的肠道定植和竞争性排除病原菌的潜力。所有三株菌均对多种食源性病原菌（如金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、芽孢杆菌Bacillus cereus、致病性大肠杆菌等）表现出广谱的抗菌活性，且安全评估显示无溶血活性，抗生素敏感性符合益生菌安全要求。

菌株鉴定与共存性

通过16S rDNA序列分析，这三株优选菌株被准确鉴定为Lactiplantibacillus plantarum SBB-HI4、Lactiplantibacillus pentosus SBB-HI8和Lacticaseibacillus paracasei SBB-GT4。为了将它们组合成多菌株益生菌制剂，研究人员进行了共存性测试，结果表明这三株菌在共同培养时没有相互抑制现象，能够和谐共存，这为开发协同作用更强的多菌株益生菌产品奠定了基础。

预益生元选择与微胶囊包埋优化

在确定菌株组合后，研究进入关键的技术优化阶段——如何提高这些益生菌的稳定性。研究人员首先评估了不同预益生元（低聚半乳糖GOS、低聚果糖FOS和菊粉Inulin）对多菌株益生菌生长的促进作用。结果发现，添加1.0% (w/v)的GOS效果最佳，使菌株生长量达到最高（对数期增加1.72，活菌数约5.22 x 10^9 CFU/mL），显著优于FOS和菊粉。因此，选择GOS作为协同包埋的预益生元。

随后，研究团队采用了双层微胶囊包埋技术。内层为1.5% (w/v)的海藻酸钠（Alginate）凝胶珠，包裹着益生菌和GOS的混合物；外层再包裹0.5% (w/v)的壳聚糖（Chitosan），形成一种核壳结构。通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察，成功制备的微胶囊呈球形，直径约2毫米，外壳光滑致密，壁厚约8-9微米，结构完整，无明显裂缝，显示出良好的包埋质量。

微胶囊包埋效果评估

对包埋效果的系统评估证实了该技术的优越性。在模拟胃肠道条件下（先pH 3.0胃液120分钟，再pH 8.0含0.6%胆盐的肠液150分钟），与未包埋的自由菌株相比，微胶囊包埋的益生菌存活率显著提高。特别是当GOS添加浓度为1.0% (w/v)时，保护效果最佳，益生菌存活率超过60%。浓度过高（如3.0%）或过低（0.5%）反而会因渗透压或底物抑制等因素导致存活率下降。在长达4个月的4°C冷藏储存稳定性测试中，双层微胶囊包埋的益生菌表现出了卓越的稳定性，活菌数始终保持在10^6 CFU/g以上（约2.6 x 10^6 CFU/g），而单一藻酸钠包埋的菌株在约90天后活菌数迅速下降，未包埋的自由菌株则在一个月内就大幅衰减，很快低于有效剂量阈值（10^6 CFU/g）。这充分证明了藻酸盐-壳聚糖-GOS协同包埋体系在保护益生菌免受环境胁迫、延长货架期方面的强大能力。

本研究成功地从泰国无刺蜂产品中分离并鉴定出三株具有优良益生特性的乳酸菌菌株：Lactiplantibacillus plantarum SBB-HI4、L. pentosus SBB-HI8和Lacticaseibacillus paracasei SBB-GT4。这些菌株不仅具备良好的胃肠道耐受性、粘附能力和抗菌活性，而且能够和谐共存。研究的创新之处在于将优选的多菌株益生菌与最适预益生元GOS相结合，并利用藻酸盐-壳聚糖双层微胶囊包埋技术，构建了一个高效的协同保护体系。该体系显著增强了益生菌在模拟胃肠道恶劣环境中的存活能力，并确保了在冷藏条件下长达四个月的储存稳定性，活菌数始终维持在有效剂量之上。这些发现不仅拓展了益生菌的资源库，揭示了无刺蜂微生物组的应用潜力，更重要的是为解决益生菌应用中的核心稳定性难题提供了切实可行的技术方案。这种稳定的多菌株益生菌制剂在改善蜜蜂健康、开发动物饲料添加剂以及用于人类的功能性食品和益生菌补充剂等领域，均展现出广阔的应用前景。