新型噬菌体鸡尾酒疗法对碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌小鼠烧伤感染模型的治疗潜力评估

《BMC Microbiology》：Evaluating the therapeutic potential of a novel bacteriophage cocktail against carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in a murine burn wound infection model

本研究针对碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌(CRPA)感染治疗难题，从环境水源分离获得三株烈性噬菌体，通过生物学特性、基因组学分析和受体结合蛋白多样性筛选，构建了具有广谱裂解活性的噬菌体鸡尾酒制剂。动物实验表明，该制剂能显著降低烧伤感染小鼠的CRP水平、细菌载量，促进伤口愈合，提高生存率，为临床CRPA感染提供了有前景的替代治疗方案。

　　

在全球公共卫生领域，抗菌素耐药性(AMR)正成为日益严峻的挑战。世界卫生组织(WHO)已将碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌(CRPA)列为2024年高度优先病原体。这种细菌是医院获得性感染的常见元凶，尤其对免疫功能低下患者构成严重威胁。烧伤患者由于皮肤屏障破坏，更容易发生铜绿假单胞菌感染，而碳青霉烯类药物的失效使得这类感染的治疗变得异常困难。

传统抗生素研发管道日益枯竭，迫使科学家将目光转向替代疗法。细菌病毒——噬菌体，因其能够特异性识别、结合并裂解细菌宿主而重新获得关注。然而，单一噬菌体治疗存在宿主范围窄、易产生耐药性等局限性。噬菌体鸡尾酒疗法通过组合多种噬菌体，能同时靶向多种细菌菌株，扩大抗菌谱，降低耐药性发生风险，成为现代噬菌体治疗的重要策略。

在这项发表于《BMC Microbiology》的研究中，Ata Vural等人系统评估了一种新型噬菌体鸡尾酒对CRPA的治疗潜力。研究人员从克孜勒河和医院重症监护室废水中分离出三株烈性噬菌体，分别命名为Baskent_P1_112(Φ1)、Baskent_P2_ICU(Φ2)和Baskent_P3_3B(Φ3)。通过全面的生物学特性表征、基因组学分析和动物实验验证，研究团队证明这一精心设计的噬菌体鸡尾酒能有效治疗小鼠烧伤伤口感染，为临床转化提供了有力证据。

研究采用的关键技术方法包括：从环境水样中分离噬菌体的双层琼脂(DLA)法；噬菌体生物学特性评估（宿主范围、最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线、温度和pH稳定性）；透射电子显微镜(TEM)形态学观察；全基因组测序(WGS)和生物信息学分析（基因组注释、毒力因子和耐药基因筛查、系统发育分析）；以及小鼠烧伤伤口感染模型的建立和治疗效果评价（伤口愈合测量、细菌载量计数、C反应蛋白(CRP)分析、组织病理学检查）。

噬菌体的生物学特性表征

研究人员成功分离出三株具有互补裂解活性的噬菌体。Φ1和Φ3来自克孜勒河不同区段，Φ2则分离自医院ICU废水。三株噬菌体在双层琼脂上呈现不同的噬斑形态：Φ1形成大而圆的噬斑，中心清晰边缘略浑浊；Φ2形成中等大小、清晰的噬斑；Φ3形成中等大小、圆形清晰的噬斑。

噬菌体的最佳MOI值分别为：Φ1为100 PFU/CFU，Φ2为1 PFU/CFU，Φ3为10 PFU/CFU。裂解量分别为123、288和115 PFU/CFU，潜伏期分别为15、20和10分钟。所有噬菌体在pH 4-10范围内保持稳定，Φ2在极端pH条件(2和12)下表现出更好的稳定性。温度稳定性评估显示，Φ3在4-50°C保持稳定，而Φ1和Φ2在10-40°C保持稳定，所有噬菌体在60°C孵育60分钟后完全失活。

TEM分析揭示了噬菌体的形态特征：Φ2和Φ3具有二十面体头部和可收缩尾部，呈肌病毒样形态；Φ1则具有短非收缩尾部，符合短尾病毒样形态。

宿主范围分析

研究团队评估了噬菌体对111株临床CRPA分离株的宿主范围。这些菌株主要来自呼吸道样本(54.1%)，其次是血培养(20.8%)、伤口(9.8%)、无菌部位(6.3%)和尿液(9.0%)。单独使用时，Φ1、Φ2和Φ3分别能裂解42株(37.8%)、42株(37.8%)和71株(63.9%)菌株。12株菌株(10.8%)对所有三株噬菌体均耐药。当三者组成鸡尾酒制剂时，宿主覆盖率达到了89.2%。

噬菌体鸡尾酒的配制基于两个关键因素：针对临床分离株的互补裂解活性谱，以及通过生物信息学预测的多样化受体结合蛋白(RBPs)。最终鸡尾酒由等体积的三种噬菌体混合而成，每种噬菌体最终滴度为10⁸ PFU/ml。

基因组序列分析

三株噬菌体的基因组已提交GenBank，登录号分别为PP766722(Φ1)、PP910332(Φ2)和PP766723(Φ3)。Φ1被分类为Bruynoghevirus属，Φ2为Pbunavirus属，Φ3为Pakpunavirus属。基因组大小分别为45,595 bp、65,693 bp和92,288 bp，GC含量在48-52%之间。

生物信息学分析确认所有噬菌体均为烈性噬菌体，不携带抗生素耐药基因、毒力基因或溶原性相关基因。Φ3基因组含有14个tRNA基因，Φ1含有3个，Φ2则不含tRNA。受体结合蛋白预测显示，各噬菌体的尾丝蛋白氨基酸序列存在差异，这解释了它们宿主范围的差异，暗示其靶向细菌宿主上不同的受体。

体内疗效评价

动物实验采用45只雌性Balb/c小鼠，随机分为5组：单纯烧伤组(G1)、感染未治疗组(G2)、毒性对照组(仅噬菌体，G3)、感染+噬菌体治疗组(G4)和感染+抗生素治疗组(G5)。烧伤模型通过250°C黄铜板接触皮肤5秒建立，烧伤面积约占体表总面积的10%。

生存分析显示，未治疗组(G2)生存率最低(66.7%)，其他各组在整个观察期间保持较高生存率。噬菌体单独给药组(G3)生存率达100%，证明噬菌体制剂纯化成功，无毒性反应。

细菌载量分析显示，G1组无细菌生长，G2组平均细菌载量为8.8×10⁶ CFU/g。治疗组中，G4组平均细菌载量为10³ CFU/g，G5组为10⁴ CFU/g。值得注意的是，G4组有3只小鼠细菌载量降为零，实现完全清除。统计分析表明，G2与G4、G5组在第三天和第七天的细菌载量存在显著差异(p=0.0093)。

伤口愈合方面，G4组表现出最高的伤口闭合率(16.6%)，其次是G5组(11.1%)。G1和G3组闭合率相似(5.5%)，而G2组未观察到闭合。

炎症指标CRP分析显示，各组间在第三天和第七天存在显著差异(p=0.0417)。未治疗组G2的CRP水平最高，而治疗组(G4和G5)呈现较低水平。特别值得注意的是，噬菌体治疗组在短时间内CRP平均下降达40%，表明噬菌体疗法不仅具有抗菌作用，还可能具有抗炎效果。

组织病理学评估显示，各组在上皮再生、炎症、新生血管形成和纤维化方面存在差异。炎症评分组间差异显著(p<0.001)，未治疗组G2炎症评分最高(达3-4级)，而治疗组炎症改变较轻。上皮再生在治疗组中更为明显，表明治疗条件下组织恢复改善。根据评分结果和显微镜评估，G4组上皮再生最显著，G2组炎症评分最高。

研究结论与意义

本研究成功分离并表征了三株新型烈性噬菌体，基于其互补裂解谱和多样化受体结合特性构建了噬菌体鸡尾酒制剂。体内实验证明，该制剂能有效治疗小鼠烧伤伤口CRPA感染，效果与抗生素治疗相当，在某些指标上甚至更优。

该研究的创新点在于建立了一套完整的噬菌体疗法开发流程，从环境分离、特性表征到体内验证，为个性化噬菌体治疗提供了可借鉴的方案。噬菌体鸡尾酒的优势在于其高病原体特异性，可避免广谱抗生素相关的微生态紊乱。此外，噬菌体表现出的抗炎效果为其在感染性疾病治疗中的应用增添了新的价值。

虽然七天的观察期相对较短，但噬菌体治疗在早期细菌清除和炎症调节方面表现出显著效果，为后续更长观察期的研究奠定了基础。未来工作可进一步评估噬菌体与抗生素的协同效应，以及在不同感染模型中的适用性。

总之，这项研究为CRPA感染的治疗提供了有前景的替代方案，特别是对于抗生素治疗失败的多重耐药菌感染病例。随着抗菌素耐药性问题日益严峻，噬菌体疗法有望成为感染性疾病治疗武器库中的重要补充。