Caspase-11通过非细胞焦亡途径调控破骨细胞分化及骨丢失的新机制

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：Non-pyroptotic caspase-11 activity regulates osteoclastogenesis and pathological bone loss

本研究揭示了caspase-11在骨质疏松等溶骨性疾病中的新功能。研究人员发现，RANKL诱导的caspase-11通过核转位直接切割PARP1，促进破骨细胞分化，而不依赖炎症小体激活。该发现为治疗骨质疏松提供了新靶点，caspase-11抑制剂VX-765在动物模型中显示出良好疗效。

　　

骨骼作为人体重要的支撑结构，其健康维持依赖于骨重塑过程的动态平衡。这一过程由破骨细胞负责的骨吸收和成骨细胞负责的骨形成共同调控。然而，随着年龄增长、雌激素缺乏（如绝经后）或炎症状态（如牙周炎）等病理条件，破骨细胞过度活化会导致骨吸收大于骨形成，进而引发骨质疏松等溶骨性疾病。目前临床常用的抗骨吸收药物如双膦酸盐类和RANKL抑制剂，长期使用可能伴随非典型骨折、颌骨坏死等不良反应，因此探寻新的治疗靶点迫在眉睫。

炎症性caspase（包括caspase-1、-4、-5和-11）是一类半胱氨酸依赖性天冬氨酸特异性蛋白酶，主要参与炎症反应。其中，caspase-11（人类中为caspase-4/-5）作为非经典炎症小体的关键组分，通常通过识别胞内脂多糖（LPS）触发细胞焦亡和IL-1β等炎症因子释放。尽管caspase-11在脓毒症等免疫相关疾病中的作用已被广泛认识，但其在骨代谢中的作用尚不明确。此前研究发现NLRP3炎症小体相关caspase-1通过炎症依赖和非依赖方式参与年龄相关的牙槽骨丢失，那么caspase-11是否以类似或独特机制参与破骨细胞分化及病理性和骨丢失？为解决这一问题，韩国全南大学校齿科大学药理学校的Jeong-Tae Koh教授团队开展了深入研究，相关成果发表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》上。

研究人员综合运用了多种关键技术方法：利用基因敲除动物模型（caspase-11敲除小鼠）和药物抑制手段（如Ac-LEVD-CHO、VX-765）在体内外水平探究caspase-11功能；通过显微计算机断层扫描（micro-CT）和TRAP染色进行骨形态计量学和破骨细胞数量分析；采用蛋白质印迹、qRT-PCR、免疫荧光等技术分析分子表达与定位；并通过体外酶切实验验证caspase-11与PARP1的直接相互作用。小鼠样本来源于C57BL/6J背景的caspase-11敲除小鼠及野生型对照。

Caspase-11在实验性骨丢失模型中表达上调

为探究caspase-11在骨丢失中的作用，研究人员首先在衰老、卵巢切除（OVX）和牙周炎三种骨丢失模型中检测其表达。通过micro-CT分析证实，与年轻小鼠相比，衰老小鼠股骨远端骨量显著降低，且抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性破骨细胞数量增加。蛋白质印迹分析显示，衰老小鼠胫骨中caspase-11蛋白（p43/p38形式）表达显著上调，且与破骨细胞标志物组织蛋白酶K（CTSK）的表达增加相关。在OVX模型中，与假手术组相比，OVX小鼠股骨骨量明显减少，TRAP阳性破骨细胞数量增多，且caspase-11（p38形式）表达显著上调。在牙周炎模型中，结扎诱导的牙槽骨丢失伴随caspase-11和CTSK的表达增加。这些结果提示caspase-11上调与多种病理条件下的破骨细胞介导的骨丢失密切相关。

RANKL诱导的caspase-11表达与活性增加不依赖炎症小体激活

在破骨细胞分化过程中，RANKL刺激可显著上调骨髓来源巨噬细胞（BMMs）中caspase-11的mRNA和蛋白表达，且其表达峰值出现在分化早期，早于多数破骨细胞标志物（如c-Fos、Nfatc1、Trap、Ctsk）。酶活性检测进一步证实caspase-11活性在早期破骨细胞分化中显著增加。信号通路抑制实验表明，仅NF-κB抑制剂（Bay11-7082）可有效抑制RANKL诱导的caspase-11表达，提示其上调依赖RANKL/RANK/NF-κB轴。

为明确RANKL诱导的caspase-11是否激活炎症小体，研究人员检测了乳酸脱氢酶（LDH）释放和IL-1β分泌等焦亡标志。与LPS转染（非经典炎症小体激活）或LPS+ATP处理（经典炎症小体激活）不同，RANKL处理仅引起微量的LDH释放和IL-1β分泌。蛋白质印迹分析也显示，尽管caspase-11表达上调，但培养上清中未检测到IL-1β、caspase-1 p20和切割的GSDMD等炎症小体相关标志。此外，使用GSDMD孔形成抑制剂LDC7559并不影响RANKL诱导的破骨细胞分化。这些结果表明RANKL诱导的caspase-11表达与活性增加不依赖炎症小体激活和焦亡，提示其发挥独特的非炎症功能。

Caspase-11正向调控破骨细胞分化

为评估caspase-11在破骨细胞生成中的功能，研究人员在BMMs中进行siRNA敲低。结果显示，caspase-11敲低导致破骨细胞标志物（Trap、Ctsk）及关键转录因子NFATc1表达显著降低，TRAP染色证实破骨细胞形成减少。类似地，使用caspase-11抑制剂Ac-LEVD-CHO处理可抑制caspase-11活性，并降低破骨细胞标志物表达、破骨细胞形成和骨吸收活性。时序实验表明，caspase-11抑制在破骨细胞分化早期（E）作用最为关键，其效果与持续抑制（EL）相当，而晚期（L）抑制影响较小，提示caspase-11在RANKL诱导的破骨细胞生成起始阶段发挥重要作用。

Caspase-11基因敲除减轻RANKL诱导的骨丢失

为验证caspase-11在体内的作用，研究人员向野生型和caspase-11敲除小鼠注射RANKL。Micro-CT分析显示，敲除小鼠基线骨量高于野生型小鼠。RANKL注射后，野生型小鼠股骨骨小梁体积分数（BV/TV）下降63%，而敲除小鼠仅下降16%；骨小梁数量（Tb.N）在野生型下降60%，敲除小鼠下降20%；骨矿物密度（BMD）在野生型下降35%，敲除小鼠下降12%。组织学分析进一步证实敲除小鼠骨小梁量增加，TRAP阳性破骨细胞数量减少。即使4周龄年轻敲除小鼠也表现出更高的骨小梁骨量，表明caspase-11在生命早期的骨重塑中即发挥作用。

Caspase-11缺陷损害RANKL诱导的破骨细胞生成

体外实验显示，与野生型BMMs相比，caspase-11敲除BMMs在RANKL刺激下破骨细胞标志物（c-Fos、Nfatc1、Trap、Ctsk、Mmp-9）表达上调受阻，TRAP染色和骨吸收陷窝形成减少。流式细胞术和qRT-PCR分析表明两组细胞RANK表达无显著差异，且RANKL诱导的NF-κB p65磷酸化水平相当，提示RANKL/RANK信号通路完整。通过逆转录病毒重新导入caspase-11可部分挽救敲除细胞的破骨细胞分化能力，证实表型由caspase-11缺失直接导致。

Caspase-11通过介导PARP1切割促进破骨细胞分化

聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）是破骨细胞分化的负调控因子。研究发现，PARP1敲低或抑制剂（rucaparib）处理可增强RANKL诱导的破骨细胞分化。Western blot显示RANKL刺激诱导PARP1切割产生p89片段，而caspase-11敲低、抑制剂处理或基因敲除均显著减弱此切割。重新导入caspase-11可恢复PARP1切割。此外，rucaparib处理可部分挽救caspase-11敲除BMMs的破骨细胞分化缺陷，表明caspase-11通过切割PARP1促进破骨细胞分化。

Caspase-11核转位并直接切割PARP1

亚细胞分级与免疫荧光显示，静息状态下caspase-11主要位于胞质，RANKL刺激后其核内积累增加，伴随PARP1切割。体外酶切实验证实重组caspase-11可直接切割重组PARP1（Asp214位点），且该过程可被Ac-LEVD-CHO抑制。为验证核定位caspase-11的功能，研究人员构建了核定位信号（NLS）标记的活性caspase-11，发现其核定位增强并显著促进PARP1切割。

靶向caspase-11减轻卵巢切除诱导的骨丢失

为探讨靶向caspase-11的治疗潜力，研究人员选用VX-765（Belnacasan），一种白细胞介素转换酶（ICE）抑制剂，可抑制caspase-1和caspase-11。VX-765处理可剂量依赖性地抑制RANKL诱导的caspase-11活化、PARP1切割及破骨细胞标志物表达，并减少破骨细胞形成和骨吸收活性。在OVX诱导的骨质疏松模型中，VX-765治疗四周可显著减轻骨量丢失（如BV/TV、Tb.N、BMD降低被抑制），并减少骨组织TRAP阳性破骨细胞数量，表明其具有治疗骨质疏松的潜力。

本研究揭示了caspase-11在破骨细胞分化和骨稳态中的新功能，其通过非炎症小体依赖的机制，在RANKL刺激下核转位并直接切割转录抑制因子PARP1，从而促进破骨细胞生成。这一发现不仅拓展了对caspase-11非焦亡功能的认识，也为骨质疏松等溶骨性疾病的治疗提供了新的潜在靶点。尽管VX-765在动物模型中显示出疗效，但其作用可能同时涉及caspase-1和caspase-11的抑制，未来开发选择性caspase-11抑制剂或利用细胞特异性敲除模型将有助于更精确地阐明其治疗潜力。总之，该研究揭示了caspase-11在骨代谢中的独特作用，为针对破骨细胞异常活化的疾病提供了新的治疗策略。