多重RT-qPCR技术检测柑橘类病毒及其在澳大利亚柑橘产业病原监测中的应用

《Australasian Plant Pathology》：Development of a multiplex RT-qPCR assay to detect citrus apscaviroids and its use in citrus viroid surveys in Australia

本研究针对柑橘类病毒（apscaviroids）检测技术瓶颈，开发了一种可同时检测五种柑橘类病毒（CBLVd、CDVd、CVd-V、CVd-VI、CVd-VII）的多重RT-qPCR方法。通过对澳大利亚主要产区近700份样本的监测，发现CDVd感染率最高（14%），并首次系统揭示该国类病毒分布特征。该技术为柑橘无性繁殖材料健康认证提供了高效工具，对全球柑橘产业病原防控具有重要实践意义。

　　

柑橘作为全球重要的经济作物，长期受到类病毒（viroids）的威胁。这类仅由几百个核苷酸组成的环状单链RNA分子，虽不编码蛋白质，却能通过嫁接等途径在柑橘树间传播，引发叶片畸形、树体矮化甚至果实减产等严重症状。更棘手的是，不同类病毒之间存在协同或拮抗作用，使得病害表现复杂多变。例如，柑橘裂皮类病毒（CEVd）在敏感砧木上引起树皮鳞片状剥落，而柑橘矮化类病毒（CDVd）却被果农有意用于控制树冠大小以实现高密度种植——类病毒竟成了“双刃剑”。

澳大利亚作为柑橘产业大国，自上世纪90年代初开展全国性类病毒调查后，四十余年来缺乏系统性监测。传统检测方法如顺序聚丙烯酰胺凝胶电泳（s-PAGE）和生物鉴定技术效率低下，且无法区分新发现的类病毒种类（如CVd-V、CVd-VI、CVd-VII）。随着柑橘产业对无病苗木需求日益增长，开发高效、精准的检测技术迫在眉睫。为此，研究团队在《Australasian Plant Pathology》发表论文，报道了一种可同时检测五种柑橘类病毒的多重实时荧光定量逆转录PCR（multiplex RT-qPCR）技术，并完成了迄今最大规模的澳大利亚柑橘类病毒本土分布调查。

关键技术方法概述

研究团队通过比对GenBank中五种柑橘类病毒（CBLVd、CDVd、CVd-V、CVd-VI、CVd-VII）的全基因组序列，在其高度保守的中央保守区（CCR）设计通用引物，并针对各病毒特异性序列设计TaqMan探针。利用柑橘主产区2019–2023年采集的694份芽条/叶片样本及44份零售水果样本，通过磁珠法提取总核酸，采用优化后的10μL反应体系进行多重RT-qPCR检测。非类病毒（CEVd、HSVd、CBCVd）检测采用已报道的多重RT-qPCR方法，阳性结果均通过单重RT-PCR或测序验证。

研究结果

1. 检测技术灵敏度与特异性验证

通过合成DNA模板稀释实验证实，该技术对单一或混合类病毒的最低检测限达100拷贝/μL。在植物核酸稀释实验中，混合感染样本中CVd-VI检测灵敏度最髙（1:10⁴稀释仍可检出），单一感染样本中CVd-VI检测限达1:10⁵。特异性测试显示，该技术对健康样本及其他柑橘病毒无交叉反应。

2. 澳大利亚柑橘类病毒分布图谱

调查显示20.9%样本携带至少一种类病毒，其中CDVd为优势种群（14.6%），其次为HSVd（5.3%）和CEVd（5.2%）。CVd-VII仅存在于首次发现地的9棵树上，CBCVd未检出。混合感染较常见，16个样本同时携带CDVd、CEVd和HSVd。零售水果检测发现13.6%的样本含类病毒，以CDVd为主，印证田间调查结果。

3. 类病毒变异与致病性关联

对CBLVd阳性样本测序发现CBLVd-LSS和CBLVd-Ia两种变异株共存。HSVd阳性样本中21.6%携带导致萎缩病（cachexia）的变异株，证实致病性变异在澳大利亚柑橘种群中流通。

结论与展望

本研究成功构建了全球首个可同步检测五种柑橘类病毒的多重RT-qPCR技术，解决了因类病毒基因组小而相似导致的检测特异性难题。大规模调查揭示了CDVd在澳大利亚柑橘园中的优势地位，反映了其作为矮化剂的故意传播与自然扩散并存的现象。该技术将显著提升澳大利亚柑橘芽条计划（Auscitrus budwood scheme）的检测效率，为全球柑橘无性繁殖材料健康认证提供技术范本。未来可通过扩大零售水果监测规模、结合高通量测序技术，动态追踪类病毒变异与传播规律，为柑橘产业可持续发展筑牢病原防控基石。