低成本环境DNA监测技术：咖啡滤纸与沉积物样本在野生鳄鱼保护中的应用研究

《Biodiversity and Conservation》：Cost-effective eDNA methods for monitoring wild crocodiles

本研究针对传统生物多样性监测方法成本高、操作复杂的问题，开发了基于咖啡滤纸和沉积物样本的环境DNA(eDNA)采集技术。研究人员通过在马达加斯加野外实验证明，这些简易方法能成功检测尼罗鳄(Crocodylus niloticus)的eDNA，为濒危物种监测提供了经济有效的解决方案，特别适用于文化敏感区域的保护实践。

　　

在全球生物多样性危机日益严峻的背景下，马达加斯加作为世界濒危生物热点地区正面临前所未有的栖息地丧失挑战。传统生物多样性调查方法需要大量人力物力和专业分类学知识，成为保护工作的实施障碍。特别是对于具有重要文化意义的顶级捕食者如鳄鱼，传统监测方法不仅操作困难，还可能触犯当地文化禁忌。

环境DNA(eDNA)技术为这一困境带来了转机。随着生物体不断向环境释放DNA，研究者可从水、土壤等介质中收集遗传物质进行物种监测。然而，当前主流的eDNA采集方法仍依赖昂贵的专用设备，在资源有限地区难以推广。针对鳄鱼eDNA的研究尤其充满挑战，先前野外研究中成功检测的案例有限，表明需要开发更简易可靠的采集方法。

在这项发表于《Biodiversity andcurity》的研究中，研究人员以马达加斯加的尼罗鳄(Crocodylus niloticus)为模型，探索了三种eDNA采集策略：标准纸质咖啡滤纸水样过滤、沉积物样本采集以及传统的Thermo Scientific eDNA过滤器。选择鳄鱼作为研究对象具有特殊意义——它们不仅是顶级捕食者，在马达加斯加文化中被视为祖先或神圣实体，受到传统禁忌(fady)保护。在这种文化背景下，非侵入性监测方法显得尤为重要。

研究方法主要包括野外样本采集、实验室DNA提取、扩增测序和生物信息学分析。研究人员在马达加斯加多个地点包括神圣湖泊Anivorano、Ankarana特殊保护区和Tsimanampesotse国家公园等采集了17份eDNA样本。样本类型包括咖啡滤纸水样、沉积物样本和Thermo Fisher专用滤器样本，采集位置选择基于当地社区报告的鳄鱼出没点，并在采样时进行了视觉确认。

实验室处理阶段，所有样本均在AMNH的古DNA和eDNA专用实验室内完成提取，使用Qiagen的DNeasy Blood and Tissue Kit和Powersoil kit分别处理滤膜和沉积物样本。研究人员采用了五对针对脊椎动物的引物，分别扩增12S、16S、ND2和COI条形码区域，通过Illumina MiSeq平台进行测序，后续使用Trimmomatic和VSEARCH等工具进行生物信息学分析。

研究结果显示，从71万条原始测序 reads中最终获得2778个OTUs(操作分类单元)。鳄鱼DNA仅在三个样本中被成功检测，全部来自Anivorano地区，包括从成年鳄鱼腹部印记采集的沉积物样本、使用咖啡滤纸过滤的鳄鱼附近水样以及鳄鱼粪便滤液样本。值得注意的是，采用Thermo Scientific专用滤器从河流采集的样本均未检测到鳄鱼DNA，尽管采样时都观察到了鳄鱼活动。

样本类型比较分析表明，咖啡滤纸检测到的类群数量最多，但沉积物样本显示了最高的物种丰富度。哺乳动物DNA占检测结果的60%，鸟类和爬行动物分别占20%和15%。除了鳄鱼，研究还检测到了标志性濒危物种环尾狐猴(Lemur catta)和??科鸟类等生物DNA，证实了该方法在群落多样性监测中的潜力。

成功检测鳄鱼DNA的样本均来自湖泊静止水体，而未成功样本则采集自流速较快的河流。这一发现与先前研究一致，表明静止水体更有利于eDNA的积累和检测。研究人员在Anivorano样本中还检测到牛属(Bos)DNA，这与当地仪式中向鳄鱼献祭斑马牛的传统相符，也从侧面验证了检测结果的可靠性。

讨论部分指出，鳄鱼DNA检测失败可能源于eDNA在水体中的不均匀分布或鳄鱼活动频率低导致DNA释放量少。在快速流动的河流中，微量的eDNA容易被稀释，降低了检测概率。相比之下，咖啡滤纸和沉积物样本在静止水体中表现优异，为鳄鱼监测提供了实用工具。

本研究的重要意义在于首次验证了咖啡滤纸作为eDNA采集工具的可行性，为资源有限地区的保护工作者提供了成本极低的监测方案。特别值得关注的是，这种方法便于社区参与，当地居民经过简单培训即可实施采样，增强了保护工作的包容性和可持续性。随着移动基因实验室在马达加斯加的推广，这种简易采样方法与本地化分析能力的结合，将为生物多样性保护开创崭新局面。

研究人员建议，在实际应用中应优先选择动物痕迹如粪便、脚印等作为eDNA来源，在河流采样时选择目标物种下游位置以提高检测成功率。这些方法不仅适用于鳄鱼监测，也可扩展到其他物种和生态系统评估中，成为人类与野生动物冲突的早期预警系统。

这项研究通过创新性的简易方法突破了eDNA监测的经济和技术壁垒，为 culturally significant species（具有文化意义的物种）的保护提供了新范式。在生物多样性丧失加速的当下，这种低成本、高包容性的监测方法将有力推动全球保护目标的实现，特别是在马达加斯加等生物多样性热点但经济欠发达地区。