基于结构导向的虚拟筛选发现Otopetrin质子通道亚基界面抑制剂及其变构调控机制研究

《Nature Communications》：Structure-guided discovery of Otopetrin 1 inhibitors reveals druggable binding sites at the intrasubunit interface

本研究针对OTOP质子通道缺乏特异性小分子调控工具的问题，通过分子对接虚拟筛选斑马鱼OTOP1结构，结合全细胞膜片钳电生理验证，发现了结合于亚基界面新型位点的小分子抑制剂C2.2（IC50=6.67μM）。冷冻电镜结构解析揭示抑制剂通过置换胆固醇结合位点实现变构抑制，为开发靶向OTOP通道的调控工具奠定基础。

　　

质子跨膜传导在生命活动中扮演着关键角色，从维持细胞内外pH稳态到介导酸味感知的神经信号产生，都离不开质子通道的精密调控。Otopetrin（OTOP）家族作为近年新发现的真核生物质子选择性离子通道，其中OTOP1被证实是介导酸味和氯化铵味觉感知的关键传感器。尽管OTOP通道的功能特性和三维结构已被初步解析，但能够特异性调控其活性的工具分子仍然匮乏，这极大限制了对该类通道生理功能和病理机制的深入研究。

传统离子通道研究高度依赖特异性激动剂或拮抗剂等小分子工具，这些化学探针不仅能用于阐明通道的结构功能关系，还能在复杂生理环境中精准调控特定通道活性。然而对于OTOP家族而言，除锌离子（Zn²⁺）和少数多效性分子（如Cibacron Blue 3GA和苏拉明）外，目前尚未发现高特异性抑制剂。虽然最近报道了三种小鼠OTOP1阳性调节剂，但针对任何OTOP亚型的特异性抑制剂仍属空白。这种工具分子的缺失使得在难以构建基因敲除动物的非模式生物中研究OTOP通道的生理功能面临巨大挑战，也阻碍了针对OTOP通道过度活化相关疾病的治疗开发。

为解决这一瓶颈问题，由Batuujin Burendei、Joshua P. Kaplan等研究人员组成的跨学科团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。研究团队创新性地采用结构导向的虚拟筛选策略，结合功能验证和冷冻电镜结构解析，成功发掘出靶向斑马鱼OTOP1（DrOTOP1）亚基界面新型结合位点的高效抑制剂，并深入揭示了其变构调控机制。

研究人员首先聚焦于DrOTOP1冷冻电镜结构（PDB: 6NF4）的C结构域口袋，因其埋藏深度适中、兼具疏水-亲水特性且含有关键功能盐桥E429-R572，被认为是虚拟筛选的理想靶点。通过对ChemBridge化合物库（约30万分子）进行分子对接筛选，并经全细胞膜片钳验证，发现化合物C11（苯偶酰单肟）在200μM浓度下可几乎完全抑制DrOTOP1电流，剂量反应曲线显示其IC₅₀为76.3μM，希尔系数h=2.2，提示存在多结合位点和正协同效应。

为进一步提升抑制剂效能，团队基于C11核心结构设计SMARTS模式进行类似物筛选，从130万分子库中精选51个化合物进行第二轮验证。其中C2.2表现最为突出，在200μM浓度下可完全阻断电流，IC₅₀达6.67μM，较C11提高10倍以上。值得注意的是，这两种抑制剂对斑马鱼OTOP1表现出显著特异性，而对小鼠和人类OTOP1同源蛋白几乎无抑制效果，这种种属选择性出乎意料，因为C结构域口袋残基在物种间具有较高保守性。

为阐明抑制剂作用机制，研究团队解析了DrOTOP1与C2.2和C2.36复合物的冷冻电镜结构。令人意外的是，抑制剂并未结合于预设的C结构域口袋，而是占据了亚基界面上的两个新型位点——面向脂质双层的“外侧位点”和面向中央腔的“中央位点”。这两个位点正是DrOTOP1中内源性胆固醇的结合位置，抑制剂通过置换胆固醇分子实现结合。

在外侧位点，C2.2与W126、G130、M133等残基形成疏水相互作用，并与W532产生π-π堆叠。中央位点中，C2.2则与V201、F277等残基发生疏水包装，并与E384形成氢键。特别值得注意的是，这两个位点均含有高度保守的带电残基（外侧位点的E267和H574，中央位点的E384和K281），可能通过质子化状态变化影响抑制剂结合。

通过系统性的位点定向突变验证，研究人员发现外侧位点的G130W、M573W和中央位点的E384A突变均显著降低C2.2抑制效能。其中G130W突变使IC₅₀右移约20倍至130.4μM，而双突变G130W/A388W进一步使IC₅₀升至397.4μM。这些功能实验数据有力佐证了冷冻电镜结构揭示的结合位点。

有趣的是，部分位点突变（如L134W、E384A和I565W）不仅影响抑制剂敏感性，还改变了通道的门控特性。L134W突变显著延缓酸激活动力学，而E384A和I565W突变则增强通道对酸性刺激的敏感性。这些发现表明亚基界面位点不仅是抑制剂结合区域，更是参与OTOP通道门控调控的关键结构域。

本研究成功建立了一套从虚拟筛选到结构验证的OTOP通道抑制剂发现流程。C2.2作为目前效力最高的DrOTOP1抑制剂（IC₅₀=6.67μM），将成为研究OTOP1结构功能关系的重要工具分子。更为重要的是，研究揭示的亚基界面结合位点在不同OTOP家族成员中高度保守，为开发靶向哺乳动物OTOP通道的调节剂提供了新策略。由于OTOP通道在心脏、子宫、脂肪组织等多种器官中均有表达，其生理功能远未完全阐明，本研究开发的小分子工具将极大推动对OTOP通道在生理病理条件下功能的解密进程。

关键技术方法包括：1）基于斑马鱼OTOP1结构的分子对接虚拟筛选；2）全细胞膜片钳电生理验证抑制剂活性；3）冷冻电镜解析蛋白质-小分子复合物结构；4）位点定向突变功能验证；5）HEK-293细胞蛋白表达与纳米盘重组技术。

虚拟筛选鉴定潜在OTOP1抑制剂

基于DrOTOP1冷冻电镜结构，通过AutoSite分析鉴定C结构域口袋为虚拟筛选靶点，从30万分子库中筛选获得50个候选化合物。

C11在全细胞膜片钳中阻断OTOP1内向电流

首轮筛选发现C11可浓度依赖性抑制DrOTOP1电流，IC₅₀=76.3μM，希尔系数h=2.2提示正协同效应。

亚结构筛选鉴定更强效OTOP1抑制剂

通过类似物筛选获得效力提升10倍的抑制剂C2.2（IC₅₀=6.67μM），并证实其对斑马鱼OTOP1的特异性。

C2.2与C2.36的冷冻电镜结构揭示结合位点

结构分析意外发现抑制剂结合于亚基界面的外侧和中央位点，而非预设的C结构域口袋，通过置换胆固醇实现结合。

外侧和中央位点突变验证抑制剂结合位点

功能实验证实G130W、M573W等突变显著降低C2.2抑制效能，双突变实验揭示两位点在抑制剂结合中的协同作用。

本研究通过结构导向的虚拟筛选成功发掘出靶向OTOP质子通道新型结合位点的小分子抑制剂，揭示了胆固醇结合位点可作为变构调控的靶标。这些发现不仅为OTOP通道研究提供了宝贵工具分子，更开辟了靶向膜蛋白-脂质界面进行药物设计的新思路。由于OTOP通道在酸感知、代谢调节等生理过程中的关键作用，针对其特异性调控剂的开发将为基础研究和治疗应用带来新的机遇。