结核分枝杆菌在巨噬细胞内的空间定位对其生存的核心调控作用

《Nature Communications》：Fundamental role of spatial positioning of Mycobacterium tuberculosis in mycobacterial survival in macrophages

本研究发现结核分枝杆菌(Mtb)在巨噬细胞内的空间定位与其生存策略密切相关。研究人员通过多种技术手段揭示，强毒株Mtb通过抑制向核周区的逆向运输而滞留于细胞外周，从而逃避溶酶体降解；而弱毒株则被运至核周区溶酶体被清除。干扰素-γ(IFN-γ)可通过TFEB-TMEM55B-JIP4轴促进Mtb向核周区运输并增强其清除。该研究阐明了空间定位如何影响Mtb代谢、复制和药物耐受性，为结核病治疗提供了新思路。

　　

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)引起的一种古老传染病，至今仍是全球公共卫生的重大威胁。这种狡猾的病原体主要寄生在巨噬细胞内，通过抑制吞噬体成熟、避免与溶酶体融合等策略，成功逃避宿主免疫系统的清除。然而，长期以来，科学家们对Mtb在宿主细胞内的"居住位置"与其生存策略之间的关联知之甚少。Mtb在巨噬细胞内究竟是如何分布的呢？这种空间定位是否会影响其代谢状态、复制能力乃至对药物的敏感性？这些问题一直悬而未解。

发表在《Nature Communications》上的这项研究首次系统揭示了Mtb在巨噬细胞内的空间定位规律及其生物学意义。研究人员发现，强毒株Mtb倾向于分布在细胞外周区域，而弱毒株则更多聚集在核周区。更为重要的是，这种空间分布的差异直接决定了Mtb的命运：位于核周区的细菌更容易被运送到溶酶体中被清除，其代谢活性低、复制缓慢，但对药物具有耐受性；而位于外周区的细菌则代谢活跃、复制快速，但对药物敏感。

为了深入探究这一现象，研究团队运用了多种先进技术方法。他们利用表达荧光蛋白的Mtb菌株，通过共聚焦显微镜观察细菌在细胞内的分布；采用ATP/ADP传感器(PHR-mCherry)和复制探针(SSB-GFP)分别检测细菌的能量状态和复制活性；通过基因敲低和抑制剂处理研究分子机制；并利用小鼠感染模型验证体内情况。此外，他们还通过免疫印迹、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀等技术分析了TFEB-TMEM55B-JIP4信号通路在IFN-γ诱导的Mtb逆向运输中的作用。

定义巨噬细胞内分枝杆菌的空间定位

研究人员首先建立了定量分析Mtb空间定位的方法。他们通过绘制以细胞核为中心的同心圆环（3μm和6μm），计算了Mtb的核周指数。正值表示Mtb更靠近核周区域，负值则表示位于细胞外周。此外，还采用了分数距离法，将Mtb与核膜的距离标准化为0到1的值，值越小表示越靠近核周区。

研究发现，活的Mtb主要分布在细胞外周，而热灭活的Mtb则更多位于核周区域。这种空间分布的差异具有重要生物学意义：核周区的Mtb更易与溶酶体标记物LAMP1共定位，表明它们更容易被运送到溶酶体中。在小鼠肺部感染模型中，研究人员也观察到了类似现象，与溶酶体共定位的Mtb主要分布在距离细胞核1μm范围内的核周区。

胞内分枝杆菌的亚细胞定位与其生物能量学、复制速率和药物耐受性紧密相关

研究人员进一步探讨了Mtb空间定位与其生理状态的关系。通过使用表达PHR-mCherryATP/ADP传感器的Mtb，他们发现核周区的Mtb具有较低的ATP/ADP比值，表明其代谢活性较低。而使用表达复制探针SSB-GFP的Mtb菌株进行实验时，发现在距离细胞核6μm以外的外周区域，有更大比例的Mtb细胞正在进行DNA复制。

更重要的是，这种代谢和复制状态的差异直接影响Mtb对药物的敏感性。用异烟肼(Isoniazid)和利福平(Rifampicin)处理感染Mtb的巨噬细胞后，存活下来的细菌主要分布在核周区域。这表明核周区的Mtb代表了持留菌群体，它们代谢活性低、复制缓慢，但对药物具有耐受性。

分枝杆菌的毒力与其亚细胞定位紧密相关

接下来，研究人员探究了Mtb毒力与其空间定位的关系。他们发现强毒株MtbH37Rv和CDC1551主要分布在细胞外周，而弱毒株MtbH37Ra则更多位于核周区。这种定位差异在感染后12小时内即可观察到，并通过三维共聚焦成像和透射电子显微镜得到了证实。

为了确定具体的毒力因子，研究人员研究了一系列基因缺失突变株。MtbΔPhoP（毒力相关调控因子缺失）、MtbΔRD1（缺失RD1区域）和MtbΔCE（缺失ESAT-6和CFP-10）都显示出核周定位的趋势，而它们的互补株则恢复了外周定位。这些结果表明，ESAT-6和CFP-10在抑制Mtb向核周区运输中起关键作用。

结核分枝杆菌的核周定位对其运送到溶酶体和清除至关重要

为了确定核周定位与Mtb清除之间的因果关系，研究人员通过基因敲低和药物抑制干扰了逆向运输过程。动力蛋白重链(DHC)的敲低或小分子抑制剂Ciliobrevin D的处理，抑制了弱毒株MtbH37Ra向核周区的运输，减少了其与溶酶体的共定位，并增强了其在巨噬细胞内的存活。

相反，通过敲低ARL8B（一种参与溶酶体向前运输的GTP酶）诱导强毒株MtbH37Rv的核周定位，可增加其与溶酶体的共定位并增强细菌清除。这些实验证明，Mtb的核周定位是其在巨噬细胞内被清除的关键因素。

IFN-γ诱导溶酶体的核周定位

干扰素-γ(IFN-γ)是控制Mtb感染的关键细胞因子，已知能促进吞噬体-溶酶体融合。本研究首次发现，IFN-γ处理还能诱导溶酶体向核周区聚集。活细胞成像显示，IFN-γ处理15分钟内即可引起溶酶体的核周聚集，同时伴随溶酶体酸化和体积增大。

IFN-γ诱导强毒分枝杆菌的核周定位及其向溶酶体的输送

IFN-γ处理同样能诱导强毒株MtbH37Rv向核周区聚集，并增加其与溶酶体的共定位。重要的是，即使在没有IFN-γ处理的对照组巨噬细胞中，Mtb与溶酶体的共定位也主要发生在核周区域。通过敲低动力蛋白或使用Ciliobrevin D抑制动力蛋白功能，可抑制IFN-γ诱导的Mtb核周定位和清除，但RILP（Rab7相互作用溶酶体蛋白）的敲低则没有此效果，表明IFN-γ通过非经典信号轴起作用。

TFEB通过增强TMEM55B和JIP4的表达和相互作用调控IFN-γ介导的分枝杆菌逆向运输

之前的研究表明，IFN-γ能诱导TFEB（转录因子EB）的核转位。本研究发现，TFEB的敲低抑制了IFN-γ诱导的Mtb向核周区的迁移，并削弱了IFN-γ的杀菌作用。机制上，IFN-γ通过TFEB依赖性方式上调了TMEM55B和JIP4的表达。染色质免疫共沉淀实验证实，IFN-γ处理后，TFEB能结合到JIP4的启动子区域。此外，IFN-γ处理还增强了TMEM55B和JIP4在溶酶体上的水平及它们之间的相互作用。

TFEB-TMEM55B-JIP4轴驱动IFN-γ介导的逆向溶酶体运输

TMEM55B或JIP4的敲低均能抑制IFN-γ诱导的Mtb逆向运输、溶酶体共定位和细菌清除。这些结果表明，IFN-γ通过TFEB-TMEM55B-JIP4轴促进Mtb负载囊泡与动力蛋白-动力蛋白激活复合物的结合，从而驱动其向核周区运输，最终导致Mtb在溶酶体中被清除。

这项研究系统阐明了Mtb在巨噬细胞内的空间定位规律及其生物学意义。研究发现不仅揭示了细菌毒力与空间定位的内在联系，还发现了IFN-γ通过TFEB-TMEM55B-JIP4轴调控Mtb命运的新机制。这些发现为理解Mtb的持久感染机制提供了全新视角，也为开发促进Mtb核周定位和溶酶体清除的新治疗策略奠定了理论基础。通过调控宿主因子的活性来改变Mtb的空间分布，可能成为未来结核病治疗的新方向。