H3K4me2/me3-ING1/2-PRC2模块通过动态抑制FT表达精准调控植物光周期开花

《Nature Communications》：A pair of readers of histone H3K4 methylation recruit Polycomb repressive complex 2 to regulate photoperiodic flowering

本研究揭示了拟南芥中H3K4me2/me3组蛋白修饰阅读蛋白AtING1/2通过识别FT染色质上的活性标记，并招募Polycomb抑制复合物2（PRC2）沉积抑制性标记H3K27me3，从而在长日照条件下实现FT表达的昼夜节律性抑制。该机制避免了FT过度激活导致的早花现象，为植物光周期开花调控提供了新的表观遗传视角。

　　

在漫长的进化过程中，高等植物发展出一套精密的机制来感知季节变化，尤其是日长变化，从而在最佳时间完成从营养生长到生殖生长的转变。这一过程被称为光周期开花。在长日照植物拟南芥中，光周期途径通过整合昼夜节律钟和光信号，诱导关键成花素基因FLOWERING LOCUS T（FT）在黄昏时分特异性表达，进而促进开花。然而，一个长期悬而未决的问题是：FT表达在黄昏被激活后，为何能在夜间和次日午后被迅速抑制，从而避免过早开花？这种精确的时序调控背后的分子机制尚不明确。

近日，发表在《Nature Communications》的一项研究揭开了这一谜题。研究人员发现，拟南芥中的ING1和ING2蛋白（AtING1/2）作为组蛋白H3第4位赖氨酸二甲基化和三甲基化（H3K4me2/me3）的“阅读器”，能够识别FT染色质上的这些活性标记，并进一步招募Polycomb抑制复合物2（PRC2），在FT黄昏激活后及时“关闭”其表达，从而防止在诱导性长日照下出现早花现象。这项研究揭示了H3K4me2/me3-ING1/2-PRC2这一新型染色质调控模块在光周期开花中的核心作用。

为开展本研究，作者主要运用了以下关键技术：蛋白质晶体结构解析（解析了ING1/2的PHD结构域与H3K4me3肽段的复合物结构）、等温滴定量热法（ITC，定量分析蛋白与组蛋白肽段的结合亲和力）、染色质免疫共沉淀（ChIP，分析蛋白及组蛋白修饰在FT染色质上的动态结合）、酵母双杂交与免疫共沉淀（验证蛋白相互作用）、遗传学分析（利用单/双突变体及回补实验验证基因功能）以及转基因和报告基因分析（研究基因表达模式及功能恢复）。

AtING1和AtING2通过其PHD结构域强结合H3K4me2/me3

研究人员首先通过ITC实验证实，AtING1和AtING2的PHD锌指结构域能以高亲和力结合H3K4me2和H3K4me3肽段，且对更高甲基化状态（H3K4me3）具有偏好性。随后，他们解析了PHD_ING1和PHD_ING2与H3K4me3肽段的晶体结构，揭示了其通过一个带负电荷的表面裂隙和芳香笼结构特异性识别H3K4me3的保守分子机制。

AtING1和AtING2以部分冗余的方式特异性抑制长日照诱导的开花

通过分析T-DNA插入突变体，研究发现ing1单突变体在长日照（LD）下中度早花，ing2单突变体表型较弱，而ing1 ing2双突变体则表现出极强的早花表型，且该表型可通过导入野生型ING1或ING2基因组片段得以回补。重要的是，这种早花表型仅在LD下出现，在短日照（SD）下则与野生型无差异，表明ING1/2特异性地抑制长日照诱导的开花。表达分析显示，ing1 ing2双突变体中FT转录本在LD黄昏时分显著升高，而在SD下无变化。组织化学染色显示ING1在叶脉中高表达，且ing1 ing2背景下的FTpro:GUS在叶脉中的表达特异性上调，证实了ING1/2在叶脉中介导FT抑制的功能。

ING1和ING2在LD周期内动态结合FT染色质

ChIP实验表明，在LD周期内，ING1和ING2蛋白在FT启动子的远端CCAAT增强子和近端CORE区域呈现出明显的振荡性结合：在中午（ZT8）和夜间（ZT24）富集，而在黄昏（ZT16）FT激活时结合消失。这种结合模式与CO蛋白的积累动态相反。在SD条件下，ING1不结合FT染色质。

ING1对FT启动子的结合受CO蛋白拮抗

尽管黄昏时分FT染色质上H3K4me2/me3水平很高，但ING1/2的结合却消失。利用化学诱导型CO表达系统，研究发现CO蛋白的积累能特异性拮抗ING1在FT启动子CORE区域的结合，长时间诱导后还能减少ING1在CCAAT区域的结合，表明CO-NF复合物的结合直接干扰了ING1/2的招募。

ING1和ING2与H3K27甲基转移酶复合物PRC2的核心亚基相互作用

酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀实验均证实，ING1和ING2与PRC2的核心组分（如H3K27甲基转移酶CLF、以及FIE、EMF2等）存在物理相互作用。

ING1和ING2动态招募CLF-PRC2以介导FT位点的抑制性H3K27三甲基化

ChIP分析显示，在野生型中，CLF在FT染色质上的富集呈现昼夜振荡（ZT8和ZT24高，ZT16低）。而在ing1 ing2双突变体中，这种振荡幅度显著减弱，CLF富集水平在ZT8和ZT24明显降低。相应地，ing1 ing2中FT启动子上的抑制性标记H3K27me3水平也下降。遗传学分析表明，ing1 ing2与clf突变体在开花时间上存在上位性效应，且clf ing1 ing2三突变体的FT表达水平与clf单突变体相似，证实INGs通过招募PRC2来抑制FT表达。

研究结论与意义

本研究首次在植物中揭示了H3K4me2/me3-ING1/2-PRC2这一染色质调控模块在光周期开花中的关键作用。该模块的工作原理十分精巧：在长日照条件下，FT启动子染色质被赋予高水平的H3K4me2/me3活性标记。在黄昏之前和之后，ING1和ING2作为“阅读器”识别这些标记，并招募PRC2沉积抑制性标记H3K27me3，从而抑制FT表达。当黄昏时分CO蛋白积累时，其形成的CO-NF转录激活复合物通过直接竞争结合位点以及招募其他激活因子（如MRG1/2）等方式，拮抗ING1/2的结合并解除抑制，促进FT表达。CO降解后，ING1/2重新结合并招募PRC2，迅速关闭FT表达。这种动态调控确保了FT表达呈现精确的昼夜节律，既能在适宜时间促进开花，又能防止过早开花。

该研究不仅阐明了FT表达昼夜节律性抑制的表观遗传机制，解决了该领域的长期疑问，还揭示了活性组蛋白标记（H3K4me2/me3）在特定情境下也可用于招募抑制复合物以实现基因的快速关闭，丰富了人们对“二价染色质”状态动态调控的理解。由于CO、ING、PRC2等核心组分在开花植物中保守存在，该调控模块可能广泛参与其他植物的光周期响应，对理解作物花期调控具有重要参考价值。