靶向降解内源性YAP的纳米抗体生物降解剂抑制肿瘤进展

《Nature Communications》：Targeted degradation of endogenous YAP by nanobody bioPROTAC inhibits tumor progression

本研究针对传统上被认为"不可成药"的致癌蛋白YAP，开发了一种新型纳米抗体生物PROTAC降解剂。研究人员通过筛选获得了高亲和力的YAP特异性纳米抗体，并将其与E3泛素连接酶RNF4的RING结构域融合，构建了能够选择性降解内源性YAP的bioPROTAC分子。该降解剂在多种YAP依赖性癌症模型中均显示出显著的抗肿瘤效果，并通过纳米颗粒和AAV载体实现了有效的体内递送，为治疗YAP依赖性肿瘤提供了新策略。

　　

在肿瘤研究领域，Yes相关蛋白（YAP）作为Hippo信号通路的核心效应因子，长期以来被视为一个"不可成药"的挑战性靶点。YAP的异常活化与多种实体肿瘤的发生发展密切相关，然而由于其缺乏传统的小分子结合口袋，开发直接靶向YAP的治疗策略一直进展缓慢。

近年来，靶向蛋白降解（TPD）技术的兴起为解决这一难题提供了新思路。其中，蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）技术通过诱导目标蛋白的泛素化降解，为靶向"不可成药"蛋白开辟了新途径。然而，传统小分子PROTAC在靶向YAP时面临特异性不足、降解效率有限等问题。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，周润华等研究人员创新性地开发了一种纳米抗体介导的生物PROTAC（bioPROTAC）策略，成功实现了内源性YAP蛋白的高效特异性降解。该研究通过系统的体外和体内实验验证了这一策略的有效性，为YAP依赖性肿瘤的治疗提供了新的解决方案。

研究人员采用的主要技术方法包括：通过天然纳米抗体噬菌体展示文库筛选获得高亲和力YAP特异性纳米抗体；构建含有RNF4 E3连接酶RING结构域的YAP-bioPROTAC融合蛋白；利用多西环素诱导的慢病毒系统评估降解效率；建立异种移植瘤模型验证体内疗效；开发基于聚乙烯亚胺/聚谷氨酸的纳米颗粒和腺相关病毒（AAV9）载体用于基因递送。研究涉及的细胞样本包括葡萄膜黑色素瘤、间皮瘤、胃癌等多种YAP依赖性癌症细胞系。

YAP特异性纳米抗体的筛选与鉴定

研究人员首先通过三轮生物淘选从天然羊驼纳米抗体噬菌体展示文库中筛选获得12个具有独特CDR3序列的YAP特异性纳米抗体。其中E3、E4和E8纳米抗体表现出最高的亲和力，平衡解离常数（K_D）分别为8.6 nM、8.2 nM和7.6 nM。通过HA pull-down实验证实了这些纳米抗体能够与内源性YAP蛋白特异性结合。

YAP-bioPROTAC的构建与降解效率验证

研究团队将筛选获得的YAP纳米抗体与RNF4 E3连接酶的RING结构域融合，构建了YAP-bioPROTAC分子（E8-2RNF4）。在多西环素诱导表达系统中，E8-2RNF4能够在多种YAP依赖性癌症细胞系中有效降解内源性YAP蛋白，降解率超过80%。时间进程实验显示YAP降解的半衰期（t_1/2）在16.8-36.8小时之间，且降解过程可被蛋白酶体抑制剂MG132阻断，表明其通过泛素-蛋白酶体途径实现降解。

E8纳米抗体的特异性验证

通过YAP基因敲除的MKN45胃癌细胞模型，研究人员证实了E8纳米抗体对YAP蛋白的高度特异性。结合ELISA、免疫共沉淀和表面等离子共振（SPR）分析，发现E8主要结合YAP的WW2结构域（155-290氨基酸区域），这为后续的特异性降解提供了分子基础。

体外抗癌活性评估

YAP-bioPROTAC在多种YAP依赖性癌细胞中表现出显著的生长抑制效果。集落形成实验显示E8-2RNF4能够有效抑制肿瘤细胞增殖，Annexin V凋亡检测证实其可诱导细胞凋亡。此外，Transwell迁移实验表明E8-2RNF4还能抑制肿瘤细胞的迁移能力。

体内抗肿瘤效果验证

在斑马鱼胚胎模型中，E8-2RNF4显著抑制了葡萄膜黑色素瘤细胞的扩散。在小鼠异种移植瘤模型中，通过多西环素诱导E8-2RNF4表达，能够显著抑制MDA-MB-231乳腺癌、MSTO-211H间皮瘤和IM95胃癌等肿瘤的生长，并延长荷瘤小鼠的生存期。免疫组化分析显示治疗组肿瘤中YAP蛋白水平显著降低，增殖标志物Ki-67表达下降。

基因递送系统的开发与应用

研究团队开发了基于聚乙烯亚胺/聚谷氨酸（PEI/PGA）的纳米颗粒递送系统，能够有效递送YAP-bioPROTAC编码质粒。体内实验表明，纳米颗粒递送的E8-2RNF4能够在肿瘤组织中实现YAP降解，并抑制肿瘤生长。此外，AAV9载体介导的基因递送也显示出良好的治疗效果，为临床转化提供了可行的递送策略。

本研究的重要意义在于首次成功开发了靶向内源性YAP的纳米抗体生物降解剂，为解决"不可成药"靶点的治疗难题提供了新范式。与传统的小分子PROTAC相比，纳米抗体生物PROTAC具有更高的特异性和亲和力，能够有效避免脱靶效应。研究还证明了通过纳米颗粒和AAV载体实现肿瘤特异性递送的可行性，为临床转化奠定了基础。

该研究的创新性体现在多个方面：首先，成功筛选获得高亲和力的YAP特异性纳米抗体，解决了YAP靶向的分子工具问题；其次，创新性地将纳米抗体与E3连接酶融合，构建了高效的降解系统；最后，通过多种递送策略实现了体内有效的基因治疗，展示了良好的临床应用前景。

然而，研究也存在一些局限性，如需要进一步优化递送系统的肿瘤特异性，以减少对正常组织的潜在影响。此外，长期YAP抑制可能带来的毒性效应也需要在后续研究中深入评估。未来研究可探索利用肿瘤特异性启动子或靶向性纳米载体来提高治疗的特异性。

总之，这项研究为治疗YAP依赖性肿瘤提供了新的治疗策略，丰富了靶向蛋白降解技术的研究范畴，为其他"不可成药"靶点的开发提供了重要参考。随着递送技术的不断优化和安全性评估的完善，YAP-bioPROTAC有望成为治疗YAP依赖性恶性肿瘤的有力工具。