综述：嵌合抗原受体细胞作为实体瘤治疗中局部递送TNFα的工具

《Human Vaccines & Immunotherapeutics》：Chimeric antigen receptor cells as a tool for localized delivery of TNFα in solid cancer treatment

本综述创新性地提出利用缺乏胞内激活域的"惰性"嵌合抗原受体（CAR）工程化细胞（T细胞、巨噬细胞、树突状细胞）进行肿瘤坏死因子-α（TNFα）的局部靶向递送，并结合凋亡蛋白抑制剂（IAP）拮抗剂（如SMAC模拟物）降解IAP蛋白，从而克服TNFα单药治疗因上调IAPs而疗效有限的瓶颈，为实体瘤治疗提供了避免细胞因子释放综合征（CRS）的新策略。

　　

ABSTRACT

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞在治疗血液癌症方面有效，但在治疗实体瘤方面效果不佳，并且可能引起严重的副作用，包括细胞因子释放综合征（CRS）。一种在癌症治疗中提高CAR-T细胞疗效同时避免CRS的策略是递送单一的杀瘤因子。TNFα以触发凋亡信号而闻名；然而，它单独使用在治疗癌症方面并不有效，因为它显著增加了凋亡蛋白抑制剂（IAPs）的水平，IAPs是一个E3泛素连接酶家族，能阻断caspase诱导的凋亡。因此，通过使用过继细胞靶向肿瘤来局部递送TNFα，并结合IAP拮抗剂（可降解IAP蛋白），可能会改善癌症治疗的结果。本文综述了TNFα诱导的凋亡信号通路，概述了设计表达TNFα的CAR-T细胞、CAR-巨噬细胞和CAR-树突状细胞的原则，这些细胞可单独使用或与IAP拮抗剂联合使用，并讨论了IAP拮抗剂与几种临床用于癌症治疗的药物之间潜在的禁忌症。

Introduction

癌症是全球主要的公共卫生问题，也是第二大死因。2024年，美国预计诊断出约2,001,140例新的侵袭性癌症，相当于每天约5,480例诊断。美国每年估计有611,720人死于癌症，前五大死因是肺癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌，分别导致125,070、53,010、51,750、42,250和35,250例死亡。

大多数实体恶性肿瘤可以通过手术切除。最具挑战性的问题是术后癌症复发和转移至其他器官，导致约90%的癌症死亡。几十年来，放疗（RT）和化疗（CT）用于术前缩小肿瘤、改善手术结果，以及术后通过杀死体内残留的癌细胞来预防复发和转移。

据估计，约30%的成年癌症患者会对传统的细胞毒性化疗方案产生反应。然而，只有2%的成年恶性肿瘤能从细胞毒性化疗中获得有意义的5年生存获益。在英格兰，约39%的5年癌症幸存者接受了放疗作为包括手术和化疗在内的根治性治疗的一部分。然而，放疗仅对10.4%的所有癌症患者提供5年局部控制获益，对2.4%的患者提供5年总生存获益。开发新的方法来预防和/或消除转移瘤存在未满足的需求。

细胞免疫疗法，即改造患者自身的免疫细胞以特异性靶向和摧毁癌细胞，将是一种有前景的癌症治疗方法。嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法是最成功的细胞免疫疗法。自2017年以来，已有六种CAR-T细胞获得FDA批准用于治疗血液癌症，包括淋巴瘤、某些形式的白血病和多发性骨髓瘤。

尽管一些临床试验显示出有希望的结果，但CAR-T细胞疗法在治疗实体瘤方面继续面临重大挑战。在最近一项研究中，尽管靶向CLDN18.2的CAR-T细胞在CLDN18.2阳性晚期胃肠道癌症患者中达到了38.8%的总缓解率（ORR）和91.8%的疾病控制率，但总生存期仅为8.8个月。此外，96.9%的患者发生了细胞因子释放综合征（CRS），8名患者（8.2%）观察到胃粘膜损伤。一项对涉及159名患者的15项前瞻性临床试验的系统评价报告称，跨不同恶性肿瘤的中位总缓解率（ORR）为62%（范围：17-100%）。相比之下，另一项包括262名患者的22项研究的荟萃分析发现，汇总的ORR仅为9%。总体而言，在大多数试验中，使用CAR-T细胞治疗实体瘤的中位无进展生存期和总生存期尚未达到。

CAR-T细胞治疗癌症的疗效取决于这些工程化细胞产生多种细胞因子，包括白细胞介素-2（IL-2）、IL-4、TGF-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α（TNFα）、IL-8和IL-10等。增强CAR-T细胞抗肿瘤疗效的主要策略是在CAR的胞质尾部加入来自各种共刺激蛋白受体（如CD28和41BB）的一个或多个胞内信号结构域，如在第二代和第三代CAR中所做的那样，以增强TCR信号。然而，CAR-T细胞疗法可能引起严重的副作用，其中最频繁和最严重的是由于大量产生细胞因子而导致的细胞因子释放综合征（CRS）。

第四代CAR-T细胞，称为TRUCKs（为抗原非限制性细胞因子 initiated killing 而重定向的T细胞），被设计用于将转基因细胞因子，如IL-12，递送到靶向肿瘤部位。一旦激活，TRUCKs上的CARs信号引导细胞在肿瘤微环境（TME）中产生和释放细胞因子。TME中细胞因子的存在增强了CAR-T细胞疗法的疗效。处于研究和开发阶段的第五代CAR-T细胞引入了额外的胞内结构域，该结构域与截短的细胞因子受体片段（如IL-2受体β链）融合。第五代CAR-T细胞的优势包括：（1）截短的细胞因子受体在抗原识别后与STAT3等转录因子相互作用以放大激活信号；（2）额外的结构域促进记忆T细胞的发育，这些细胞可以在体内持续更长时间，从而产生更持久的抗肿瘤反应和更好的结果，同时降低某些副作用的风险。

尽管第四代和第五代CAR-T细胞可以改善其疗效并限制副作用，但CAR胞质信号尾部中的激活结构域和一个或两个共刺激结构域（通常是CD28或41BB）仍然是激活CAR-T细胞所必需的，因此无法避免多种细胞因子的释放及相关副作用。特别是，CAR-T细胞疗法的抗肿瘤疗效依赖于宿主事先通过全身照射、高剂量化疗和/或输注后细胞因子支持进行淋巴细胞清除。与这些必要预处理方案相关的毒性可能限制这种方法对大多数本可从肿瘤靶向过继T细胞疗法中获益的患者的适用性。

我们最近报道了一种用于实体癌治疗中局部递送单一杀瘤因子的"惰性"过继细胞转移（ACT）方法。这种ACT的显著特点是CAR的胞内信号尾部既缺乏激活域也缺乏共刺激域，同时过表达单一杀瘤因子，从而避免了多种细胞因子的释放。表达TNFα的CAR-树突状细胞（CAR-DCs）联合IAP拮抗剂（SMAC模拟物）治疗乳腺癌的疗效已在体内进行了测试。在这篇综述和前瞻性文章中，我们首先介绍TNFα诱导的凋亡信号通路，解释为什么IAP拮抗剂对于TNFα诱导凋亡是必要的。然后，我们概述了改造T细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs）以同时表达CAR和TNFα的原则，并讨论了将IAP拮抗剂与基于CAR细胞的局部TNFα递送以及其他治疗药物（包括化疗药、抗生素和双膦酸盐）联合用于癌症治疗时潜在的禁忌症。

TNFα induces limited apoptosis due to the upregulation of inhibitor of apoptosis proteins and contributes to tumor progression by modulating the tumor microenvironment

TNFα最初被鉴定为一种杀瘤细胞因子。大约40年前进行了一些使用重组TNFα治疗癌症的临床试验。然而，很少有癌症患者对TNFα治疗产生反应，并且在大多数接受TNFα治疗的患者中观察到全身毒性，包括发热、寒战、厌食和恶心。在进行那些研究时，TNFα的许多生物学特性、调控和作用靶细胞尚不清楚。至今，大量证据表明TNFα不仅诱导癌细胞凋亡，而且上调凋亡蛋白抑制剂（IAPs），从而限制其自身的促凋亡作用。此外，TNFα通过调节肿瘤微环境促进癌症进展和转移。

TNFα与两个受体TNFR1和TNFR2结合以发挥其生物学功能。TNFα与TNFR1的结合通过招募TNFR1相关死亡结构域（TRADD）和FAS相关蛋白死亡结构域（FADD）触发凋亡级联反应。这些衔接蛋白与caspase 8的死亡效应结构域相互作用，形成死亡诱导信号复合物（DISC），通过激活线粒体外膜上的促凋亡Bcl-2家族成员Bax和Bak，引发一系列事件，最终导致细胞死亡。结果，细胞色素c从线粒体释放到胞质中，在那里它与凋亡蛋白酶激活因子1（APAF1）和caspase 9形成凋亡体，诱导凋亡。

TNFR2缺乏死亡结构域，因此介导TNFα诱导的癌症进展和转移。大量证据表明TNFα可诱导上皮-间质转化（EMT），从而促进癌症发展。TNFα还直接刺激癌细胞迁移和侵袭，支持其在促进转移行为中的作用。TNFα的促肿瘤或抗肿瘤作用可能取决于其浓度。虽然高浓度的TNFα可以诱导癌细胞死亡，但低水平可能反而促进肿瘤进展。

事实上，许多癌细胞通过过表达IAPs来避免细胞死亡，IAPs阻断caspases诱导的凋亡。IAPs是一个E3泛素连接酶家族，包括八个成员：NAIP (Birc1)、cIAP1 (Birc2)、cIAP2 (Birc3)、X-IAP (Birc4)、Survivin (Birc5)、Bruce (Birc6)、Livin (Birc7) 和 ILP-2 (Birc8)。cIAP1、cIAP2、XIAP和Survivin在阻断凋亡中的作用已得到充分表征，而其他IAP家族成员的功能仍知之甚少。

XIAP、cIAP1、cIAP2和Survivin各含有一到三个杆状病毒IAP重复（BIR）结构域，这些是约70个氨基酸的锌结合基序。这些BIR结构域直接与效应caspases（如caspase-3和-7）结合，阻断它们的活性位点，从而阻止底物切割并抑制凋亡。此外，IAPs，尤其是XIAP，在其C末端含有一个RING指结构域，赋予其E3泛素连接酶活性。通过其BIR结构域与caspases结合后，RING指结构域促进泛素分子从E2泛素结合酶转移到caspase，导致其泛素化。泛素化的caspase被26S蛋白酶体识别，导致caspase降解，从而消除其凋亡活性。

最近有报道称，巨大的IAP Birc6表现出双重的E2和E3泛素连接酶活性，使其能够通过泛素化caspases -3、-7和-9，专门与非经典E1酶UBA6协作，来限制效应caspases -3和-7。Birc6的泛素样结构域还结合LC3的相互作用区，从而诱导caspase 9的自噬降解以抑制凋亡。值得注意的是，第二线粒体来源的caspase激活剂（SMAC）紧密结合Birc6以释放caspase，从而触发凋亡。然而，Birc6也通过与泛素激活酶UBA合作诱导LC3B的单泛素化和蛋白酶体降解，作为自噬的负调控因子。

我们报道高侵袭性三阴性乳腺癌（TNBC）细胞表达升高的cIAP1和cIAP2蛋白水平。暴露于TNFα进一步上调它们的表达，使得TNFα无法有效杀死这些细胞。相反，侵袭性较低的雌激素受体（ER）阳性乳腺癌细胞表达低基础水平的cIAP1和cIAP2，且不被TNFα诱导。因此，TNFα单独使用通过诱导凋亡来抑制这些ER阳性细胞的增殖。TNFα主要通过激活NF-κB来上调IAPs，NF-κB直接结合IAP基因启动子并增强其转录。此外，脂多糖（LPS）诱导的Myd88直接结合并稳定cIAP1和cIAP2。目前尚不清楚TNFα是否以及如何通过转录后调控上调IAPs。

作为一种促炎细胞因子，TNFα主要通过调节肿瘤微环境来影响癌症命运。它上调VEGF和IL-6，促进血管生成，并增加基质金属蛋白酶的表达以降解细胞外基质和促进转移。TNFα与TNFR1的结合激活炎症巨噬细胞产生高水平的VEGF-C，进而激活VEGFR3促进淋巴管生成，从而有助于癌症的淋巴转移。TNFR2在调节性T细胞（Treg）和髓源性抑制细胞（MDSCs）中高表达，因此参与TNFα诱导的这些免疫抑制细胞的募集和分化，导致肿瘤免疫监视的逃逸，并有助于对免疫检查点抑制剂疗法的抵抗。

总之，TNFα上调IAPs以抑制其自身的促凋亡信号，这解释了为什么TNFα单独使用对治疗某些癌症无效。此外，TNFα通过驱动血管生成和淋巴管生成，以及诱导免疫抑制细胞，促进肿瘤进展和转移。

Degradation of IAPs by an IAP antagonist enables TNFα to induce apoptosis

当细胞发生凋亡时，通常位于线粒体膜间隙的内源性第二线粒体来源的caspase激活剂（SMAC）被释放到胞质中以降解IAPs，导致caspase激活从而触发凋亡。已经开发了许多合成的SMAC模拟物，也称为IAP拮抗剂，旨在通过降解IAPs来治疗癌症。其中一些，如LCL161、GDC-0917、AT-406（xevinapant）和TL32711，已经在I期或II期临床试验中进行了研究，但大多数患者并未从中受益。值得注意的是，单独使用IAP拮抗剂，如SM-164、xevinapant或BV6，即使在高浓度（例如1μM）下也不会诱导显著的癌细胞死亡。然而，在存在低水平TNFα（例如1 ng/mL）的情况下，这些IAP拮抗剂在低得多的浓度（从低至3 nM到100 nM）就能强力诱导癌细胞凋亡。我们最近的报告显示，通过腹腔注射给予SM-164联合TNFα（而非单独使用SM-164）可显著减少乳腺肿瘤在骨中的生长，并保护骨骼免受癌症诱导的骨溶解。相反，在SM-164疗法中加入TNFα抗体（Ab）会显著增加乳腺肿瘤的生长，并且似乎比单独使用SM-164增加骨溶解。这些发现强烈表明，TNFα和IAP拮抗剂的组合可能是治疗晚期癌症的有效疗法。然而，TNFα在人体内可能引起严重的副作用，包括全身性休克和炎症反应。IAP拮抗剂与TNFα组合可杀死多种癌症，包括乳腺癌。因此，将TNFα局部递送到靶向肿瘤，结合口服或静脉注射的IAP拮抗剂，将是一种有吸引力的方法，以更少的副作用强效且特异性地治疗这些癌症。

Design of the vector expressing the CAR and TNFα

与传统CAR类似，一种"惰性"CAR（iCAR）由四个主要部分组成：一个细胞外结构域（即抗原识别域scFv）、一个铰链区、一个用于将抗原识别域锚定在细胞膜上的跨膜结构域，以及一个胞内信号结构域。iCARs与传统CARs的关键区别在于它们的胞内信号结构域。传统CARs在胞内信号区整合了一个或两个共刺激结构域，如CD3ζ和4-1BB，以增强T细胞活化和持久性，使其能够通过释放高水平的多种细胞因子来摧毁靶向癌细胞。相比之下，iCARs保留了一个未修饰或截短的胞内信号结构域，该结构域缺乏激活和共刺激元件，而是过表达单一杀瘤因子——从而避免了多种细胞因子的释放。

构建CAR时，通常使用细胞受体的跨膜结构域来锚定细胞外抗原识别域，该域是一个结合癌细胞表面抗原的单克隆抗体scFv。关键是该受体在被工程化的细胞表面稳定且高表达。如果使用T细胞递送TNFα，可以选择在T细胞上高表达的受体（例如CD3、CD4、CD8和CD28）来构建CAR。如果使用巨噬细胞或树突状细胞（DC）靶向癌症，可以选择在髓系细胞中高表达的受体（例如CD11c、CD14、CD16、CD18、CD33、CD66b (CEACAM8)、CD86等）来构建CAR。

细胞受体的细胞外结构域被替换为针对肿瘤特异性细胞表面蛋白的抗体的单链可变片段（scFv）以构建CAR。scFv通过铰链或间隔区与受体的跨膜结构域连接，如同传统CAR一样。铰链影响CAR细胞的整体性能。理想的铰链能促进抗原结合和CAR与靶抗原之间突触的形成，并为有效的CAR表达和活性提供稳定性。据报道，与CD28铰链相比，高度灵活的IgD铰链使得CAR-T细胞能更好地识别空间位阻的MUC1表位。稳定的CAR表达和抗原识别是iCAR疗法成功的最重要因素。可用于构建iCAR的铰链序列的一个例子是"ESKYGPPCPSCP"。目前尚不清楚铰链修饰如何影响这种iCAR的表达和抗原识别。

用于惰性CAR靶向的肿瘤表面蛋白与传统CAR相似，例如B细胞恶性肿瘤上的C19和BCMA（B细胞成熟抗原），急性髓系白血病上的CD33。对于实体瘤，表达在癌细胞表面的肿瘤相关抗原（TAAs）可以被CAR靶向。TAAs的例子包括肺癌上的表皮生长因子受体（EGFR），间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和乳腺癌上的间皮素，各种上皮癌（包括乳腺、胰腺、肺、卵巢、膀胱和胆囊癌）上表达的粘蛋白1（MUC1），神经母细胞瘤上的GD2，前列腺癌上的前列腺特异性膜抗原（PSMA），以及胃肠道癌症上的CDH17。应注意，与血液癌症不同，实体瘤通常缺乏单一、高度特异性的肿瘤抗原，因此很难为过继细胞疗法找到理想的靶点。此外，正常细胞也低表达这些肿瘤抗原，导致潜在的脱靶效应。然而，过继细胞的脱靶不会对正常细胞造成严重的副作用，因为正常细胞表达低水平的IAP蛋白，并且对IAP拮抗剂治疗不敏感。

受体中跨膜和胞内信号结构域的序列可以保持不变。因为不需要工程化细胞的激活，所以不会将激活和共刺激分子整合到胞质尾部。为了进一步减少惰性CAR的激活，胞内信号尾部可以被截短。

人TNFα最初合成为一个由233个氨基酸残基组成的前体蛋白。它是一种II型膜蛋白，表达在活化的巨噬细胞、淋巴细胞和其他细胞上。前体蛋白在残基76（丙氨酸）和77（缬氨酸）之间被金属蛋白酶TNFα转换酶（TACE）切割，导致由157个氨基酸残基组成的可溶性TNFα形式的释放。可溶性TNFα与其1型和2型受体结合以发挥其生物活性。

大量证据表明可溶性和跨膜TNFα（tmTNFα）都是有功能的。TmTNFα足以诱导伴有关节滑膜增生和炎症的关节炎。TmTNFα的细胞毒性可以直接导致癌细胞裂解，这种作用被IAP拮抗剂增强。因此，装备有tmTNFα的CAR细胞将在局部以较少的全身副作用杀死癌细胞，特别是当与IAP拮抗剂一起给予时。

鉴于实体瘤通常是缺氧的，装备好的CAR-T细胞可能难以浸润肿瘤，因为肿瘤微环境中的缺氧与CD8⁺ T细胞浸润减少和活性受损有关。这可能是CAR-T细胞疗法治疗实体瘤失败的一个关键原因。目前尚不清楚过继细胞产生的可溶性TNFα是否能渗透到肿瘤内部发挥其功能。未来应进一步研究由装备好的CAR细胞表达的可溶性TNFα与tmTNFα的有效性。还应进一步研究表达tmTNFα的装备好的CAR细胞在癌症治疗后是否会在周围组织中引起局部炎症。预计表达可溶性TNFα的装备好的细胞将引起较少的副作用，因为进入循环的TNFα通过肝脏中的受体介导的内吞作用被清除，通过肾脏排泄，结合到各种细胞类型上的特定受体，并在血清中经历钙依赖性蛋白酶体降解。尽管如此，在治疗期间和治疗后应监测循环中的TNFα水平。

所有FDA批准的CAR-T细胞疗法都使用γ-逆转录病毒或慢病毒，它们能有效地将CAR基因转导到T细胞基因组中，实现CAR的稳定表达。这两种病毒都属于逆转录病毒科。两种载体之间的区别在于，γ-逆转录病毒载体只感染分裂细胞，而慢病毒载体既能感染分裂细胞也能感染静止细胞。表1列出了FDA批准的CAR-T细胞生产中使用的病毒载体。

CAR和TNFα cDNA可以克隆到同一个慢病毒载体中，但由两个不同的启动子驱动，如图2(C)所示。另一种方法是将CAR和TNFα cDNA克隆到两个单独的载体中，然后将两种病毒以1:1的比例混合感染细胞，从而产生过继细胞。然而，合并两种病毒会降低产生同时表达CAR和TNFα的细胞的效率。

Candidate cells for localized delivery of TNFα

与传统CAR类似，任何造血细胞，如T细胞、自然杀伤细胞（NKs）、单核细胞/巨噬细胞（Macs）和树突状细胞（DC），只要能够从血流迁移到肿瘤中，都可以用表达CAR和TNFα的慢病毒感染，以产生用于局部递送TNFα的过继细胞。

然而，细胞在血液中的丰度、其在体外充分扩增的能力以及其在体内的寿命将决定是否选择该细胞作为局部递送TNFα的工具。过继细胞通过CAR识别肿瘤抗原与癌细胞结合，在给予IAP拮抗剂时局部产生TNFα并杀死癌细胞。

T cell as a candidate for delivering TNFα by targeting tumors

T细胞是外周血单核细胞（PBMCs）中最丰富的细胞类型，约占PBMCs的70%。特别是，T细胞在悬浮液中扩增和生长，使其易于收获。重要的是，CAR-T细胞已成功用于治疗几种血液癌症。因此，T细胞作为递送TNFα的工具有很大的潜力快速过渡到临床应用。

在T细胞内，CD4⁺ 辅助性T细胞通常比CD8⁺ 细胞毒性T细胞占更大的百分比，比例大致为2:1。T细胞的寿命因其类型和功能而异。在胸腺中新产生的初始T细胞寿命长，通常持续数年。免疫反应后产生的记忆T细胞可以存活数十年。CD4⁺ 和CD8⁺ 记忆T细胞的平均寿命约为150-160天。效应性（辅助性和细胞毒性）T细胞寿命短，通常在免疫反应后几周内死亡。考虑到TNFα联合IAP拮抗剂的治疗疗程约为3周，效应性T细胞——无论是CD4⁺ 辅助性还是CD8⁺ 细胞毒性T细胞——将是产生这些惰性CAR-T细胞的理想选择，就像传统的CAR-T细胞一样。

通常，向患者输注单剂量的数亿个CAR-T细胞（1-3百万/公斤）用于癌症治疗。CAR-T细胞的制造过程通常需要3-6周，包括分离CD4⁺ 辅助性或CD8⁺ 细胞毒性T细胞、T细胞激活和扩增、基因修饰以诱导CAR表达、体外选择和扩修饰的T细胞，然后是最终制剂、冷冻保存、质量控制分析，并转移给患者。一个挑战是，大约三分之一患者在制造过程中疾病进展可能使他们无法安全地进行CAR-T细胞治疗。鉴于惰性CAR-T细胞被设计为表达高水平的TNFα，值得研究是否输注较小数量的这些工程化细胞，结合IAP拮抗剂，可以在不需要事先对宿主进行淋巴细胞清除的情况下有效治疗癌症。

一个问题是T细胞只存在于实体瘤的基质或上皮内衬组织中，无法浸润到肿瘤团块深处。这可能是CAR-T细胞治疗实体癌失败的一个原因。不建议工程化T细胞表达tmTNFα用于治疗实体癌，因为细胞间相互作用是表达tmTNFα的细胞发挥功能所必需的，而CAR-T细胞穿透实体瘤内部的潜力有限。然而，我们仍然不知道由惰性CAR-T细胞分泌的可溶性TNFα在给予IAP拮抗剂时是否能有效渗透到内部并杀死肿瘤。

Macrophage as a tool for localized delivery of TNFα by targeting tumors

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）不仅是许多实体瘤中肿瘤基质的主要组成部分，而且浸润到肿瘤内部。实体瘤中巨噬细胞（Macs）的比例因癌症类型、分期、肿瘤微环境和所使用的检测方法而有显著差异。一项研究报告称，在胰腺癌、肺癌和胆囊癌中，CD163阳性Macs约占肿瘤面积的7%。然而，其他综述文章表明TAMs可占肿瘤总质量的50%。特别是，CAR-巨噬细胞（CAR-Macs）可以在动物模型中穿透到转移性乳腺肿瘤内部。因此，CAR-Macs递送TNFα结合IAP拮抗剂将是治疗癌症的一种有前景的方法。任何对IAP拮抗剂存在下TNFα诱导的凋亡敏感的癌症都有可能用这种方法治疗。这类实体瘤包括乳腺、肺、胰腺、卵巢、结直肠、前列腺和胆囊癌。

制造CAR-Macs的过程相对简单。通过红细胞裂解或密度梯度离心从人全血中分离出的白细胞（WBCs）或外周血单核细胞（PBMCs），可以直接用M-CSF培养以在体外生成Macs。这些Macs紧密附着在培养皿上生长，因此可以将携带CAR和TNFα基因的病毒颗粒直接添加到培养基中以生成CAR-Macs。整个过程大约需要10-12天。然而，获得足够数量的CAR-Macs仍然是一个挑战，因为只有10-20%的PBMCs是单核细胞，而单核细胞在健康个体中占WBCs的2-8%。这些Macs很可能直接从悬浮的单核细胞分化而来，进一步分裂的潜力差。根据我们的经验，来自成人个体10毫升新鲜血液的WBCs在使用M-CSF培养一周后产生约2x10⁶个Macs。平均而言，80毫升全血产生大约1000-2000万个CAR-Macs，而可以产生1亿个CAR-T细胞。如前所述，CAR-Macs高表达TNFα，当与IAP拮抗剂结合时，较小数量的这些CAR-Macs就足以靶向和杀死癌症。特别是，有可能将非常小数量的CAR-Macs局部注射到实体瘤中，同时获得更好的治疗效果。如果需要更多的CAR-Macs，建议从骨髓活检获取的骨髓细胞用于Mac的生成和工程化，前提是患者状况允许。一个具有挑战性的问题是，M-CSF诱导的Macs紧密附着在培养皿上，使得很难使用胰蛋白酶消化液来收获它们。

Dendritic cell (DC) as an ideal tool for delivering TNFα locally by targeting tumors

DCs和Macs来源于相同的巨噬细胞/树突状祖细胞（MDPs）。外周血中存在少量DCs。然而，用GM-CSF单独或联合IL-4处理血液单核细胞可诱导单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）的形成。在培养皿上生长的DCs可以直接用慢病毒感染以产生表达分泌型TNFα的CAR-DCs。重要的是，CAR-DCs在胰蛋白酶消化后比CAR-Macs更容易从培养皿上 detached。

人PBMCs产生的DCs数量（由M-CSF和GM