脂质纳米粒介导SOX5/SOX9 mRNA协同递送逆转软骨细胞衰老的骨关节炎治疗新策略

《International Journal of Nanomedicine》：Optimized Lipid Nanoparticle-Mediated mRNA Co-Delivery of SOX5/SOX9 Enables Synergistic Senescence Reversal for Osteoarthritis Therapy

本研究开发了一种基于优化脂质纳米粒（LNP）的mRNA共递送平台，用于高效递送转录因子SOX5和SOX9的mRNA至软骨细胞。该策略通过协同作用显著增强合成代谢信号，促进关键软骨细胞外基质（ECM）成分（如II型胶原和聚集蛋白聚糖）的合成，并在体外和体内（ACLT诱导的OA大鼠模型）中减少炎症介导的基质降解，为骨关节炎（OA）提供了具有前景的疾病修饰疗法。

　　

LNP Formulation and Characterization

为建立针对软骨细胞的高效mRNA递送平台，研究系统设计并评估了七种基于SM-102的脂质纳米粒（LNP）配方（I–VII）。透射电子显微镜（TEM）显示所有LNP均呈现均匀的球形形态和单分散外观。动态光散射（DLS）分析表明，七种LNP配方的流体动力学直径在100至200纳米之间，该尺寸范围有利于网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用及软骨内扩散。Zeta电位分析显示配方表面电荷接近中性，有利于减少非特异性蛋白吸附并延长循环时间。所有LNP的多分散指数（PDI）均低于0.3，表明粒径分布窄，胶体稳定性良好。这些理化性质表征证实合成的LNP具备用于核酸递送的理想特性。

In vitro and in vivo Luciferase mRNA LNP Delivery

为了评估SM-102基LNP配方的mRNA递送效能和关节特异性趋向性，研究将编码荧光素酶的mRNA封装到七种候选LNP（配方I–VII）中，并评估其在原代软骨细胞中的转染效率。体外实验显示，配方I、II和IV的转基因表达水平显著较高，其中配方II（SM-102: 60%，胆固醇: 28.5%，DSPC: 10%，DMG-PEG2000: 1.5%）显示出最高的荧光素酶活性，表明其在软骨细胞中具有最优的mRNA递送效率。在大鼠体内实验中，通过单次关节内注射给药，并在注射后12和24小时使用IVIS Spectrum成像系统进行活体生物发光成像。结果显示，配方II在两个时间点均产生最强的生物发光信号，且表达更持久，表明其在关节腔内具有增强的细胞内递送和表达效率。这些发现共同支持配方II作为软骨细胞靶向mRNA递送的最佳LNP组成。

Establishment and Validation of a Senescent Chondrocyte Model

为了模拟骨关节炎软骨中观察到的衰老表型，研究使用过氧化氢（H₂O₂）诱导的氧化应激建立了软骨细胞衰老的体外模型。通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色证实，与未处理的对照组相比，SA-β-Gal阳性细胞显著增加。蛋白质印迹（Western Blot）分析显示，关键软骨生成标志物（SOX5、SOX9和II型胶原（COL II））的表达显著下降，而细胞周期抑制剂p21的表达上调。这些结果共同证实了衰老软骨细胞模型的成功建立。

In vitro And in vivo Biocompatibility of the SOX5/9@LNPs

对SOX5/9@LNPs的生物相容性进行了全面评估。体外细胞毒性试验显示，在原代大鼠关节软骨细胞和大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）中，即使最高剂量下，细胞活力仍保持在90%以上，表明其具有宽广的治疗窗口和良好的剂量耐受性。活/死染色进一步证实了高细胞活力。对大鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）的评估表明，LNP处理未引起显著的促炎细胞因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）分泌增加，表明未引发炎症反应。在大鼠体内，通过尾静脉注射进行全身给药后，对主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的组织病理学评估未观察到组织损伤、坏死、炎症或异常组织结构。血液常规和生化分析（如ALT、AST、ALP、BUN、CREA）参数均在正常范围内，无系统性毒性证据。这些结果共同证明了SOX5/9@LNPs在体外和体内均具有优异的生物相容性。

In vitro Evaluation of SOX5/9@LNP-Mediated Cartilage Regeneration and Senescence Alleviation

研究评估了SOX5/9@LNPs在H₂O₂诱导的衰老软骨细胞中的抗氧化和衰老逆转潜力。荧光成像和流式细胞术分析显示，SOX5@LNP和SOX5/9@LNP处理显著降低了细胞内活性氧（ROS）水平，其中SOX5/9@LNP组效果最显著。对衰老软骨细胞进行分子和功能分析表明，SOX5/9@LNP处理随时间推移（1、4、7天）逐渐增加了软骨特异性标志物（SOX5、SOX9、COL II）的蛋白表达，同时显著下调了衰老相关蛋白p21的表达。实时定量PCR（RT-qPCR）结果在转录水平上与此一致：SOX5/9@LNP处理显著上调了COL II和聚集蛋白聚糖（ACAN）的mRNA水平，并显著降低了p21的表达。划痕实验表明，SOX5/9@LNP处理显著增强了衰老软骨细胞的迁移能力。免疫荧光分析进一步证实，SOX5/9@LNPs处理提升了COL II和ACAN的表达，降低了p16和p21的荧光信号，并改善了线粒体膜电位（JC-1染色显示红/绿荧光比率更高）。此外，研究还评估了SOX5/9@LNPs在诱导大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）软骨向分化方面的能力。Western Blot和免疫荧光分析显示，SOX5/9@LNPs处理能时间依赖性地上调rBMSCs中COL II蛋白的表达，表明成功激活了软骨生成转录程序并增强了细胞外基质合成。

In vivo Evaluation of Cartilage Regeneration with SOX5/9@LNP Injection

为全面评估SOX5/9@LNPs的体内治疗效果，研究采用了前交叉韧带横断（ACLT）大鼠模型模拟人类OA的进行性软骨退化。术后两周开始，每周两次关节内注射SOX5@LNP、SOX9@LNP或SOX5/9@LNP，持续两周。动物在术后第4周和第8周处死进行关节分析。微型计算机断层扫描（micro-CT）分析显示，OA对照组出现典型的病理重塑，表现为骨小梁丢失、连接性降低和孔隙率增加。与之相比，SOX5/9@LNP治疗有效保留了软骨下骨的微结构，三维重建显示骨小梁结构更致密、更有组织，骨体积分数（BV/TV）、组织体积比（BS/TV）和连接密度（Conn.D）显著增加，骨表面积体积比（BS/BV）和骨小梁分离度（Tb.Sp）降低。组织学评估与micro-CT结果一致。苏木精-伊红（H&E）染色显示，SOX5/9@LNP组在8周时保持了完整的软骨表面、有组织的软骨细胞柱和坚固的基质完整性。Masson三色染色证实了更好的胶原纤维连续性。番红O/固绿（SO-FG）和甲苯胺蓝染色显示SOX5/9@LNP组糖胺聚糖（GAGs）保留更明显。II型胶原（COL II）免疫组化染色显示了均匀且强的基质蛋白表达。定量OARSI组织学评分表明，SOX5/9@LNP治疗在8周时显著降低了软骨退化评分。这些结果表明，SOX5/9@LNPs的关节内给药显著增强了软骨完整性，保留了软骨下骨结构，并在关节损伤后的早期和中期阶段减轻了骨关节炎性退化。

RNA Sequence Analysis

对SOX5/9@LNP处理和未处理的OA组软骨细胞进行RNA测序。差异表达分析揭示了显著的转录组变化，共有487个基因显著上调。值得注意的是，一些应激和代谢相关基因（如Sod2, Gbe1, Car9, Pgk1）在IL1B刺激下高度上调，但在SOX5/9@LNP处理后显著下调，表明干预措施缓解了炎症和氧化应激反应。功能富集分析表明，这些差异表达基因与细胞外基质组织、血管生成、ECM-受体相互作用和MAPK信号通路等相关，这些通路对软骨稳态和修复至关重要。蛋白-蛋白互作（PPI）网络分析确定了116个高置信度互作对，涉及SOX9、SOX5、COL2A1、ACAN、MMP3、P21和SOD2等基因，突出了基质合成、衰老和炎症之间的相互作用。Western Blot分析验证了MAPK通路核心组分（ERK, JNK, p38）及其磷酸化形式的蛋白水平在SOX5/9@LNP处理组显著增加，表明MAPK信号级联被激活。与正常组的比较分析显示，SOX5/9@LNP处理使炎症和衰老相关转录本正常化，并恢复了与细胞周期和有丝分裂纺锤体组织相关的通路，表明其将OA软骨细胞部分重编程向更具增殖性、再生性的状态，而未引起脱靶或全局转录失调。

Conclusions

研究成功开发了一种通过合理优化的SM-102基脂质纳米粒（SOX5/9@LNP）共递送SOX5和SOX9 mRNA的双功能mRNA纳米治疗平台，用于骨关节炎（OA）治疗。该体系同时靶向软骨再生和软骨下骨保护。在体外，SOX5/9@LNP有效逆转了软骨细胞衰老，增强了细胞外基质合成，并促进了骨髓间充质干细胞的软骨向分化，效果优于单因子递送。在体内，SOX5/9@LNPs的关节内给药在ACLT诱导的OA大鼠模型中显著保留了软骨结构和软骨下骨完整性。该策略具有优异的生物安全性和强大的再生效果，代表了一种有前景的OA疾病修饰方法。