ROS/葡萄糖双重响应型EGCG包覆释氧纳米复合水凝胶在糖尿病伤口治疗中的创新应用

《International Journal of Nanomedicine》：ROS/Glucose-Dissociable EGCG-Coated Oxygen-Supplying Nanocomposite Hydrogel for Diabetic Wound Therapy

本文报道了一种基于ROS/葡萄糖双重响应的多功能释氧纳米复合水凝胶（GP-GL@Ca-E），该系统通过苯硼酸接枝季铵化壳聚糖（QCS-PBA）封装过氧化钙（CaO2），并利用硼酸酯键锚定表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）构建功能化纳米粒，最终整合至光固化明胶水凝胶中。研究证实该体系能精准响应伤口微环境中的活性氧（ROS）与葡萄糖，实现EGCG的控释与持续氧供应，有效缓解缺氧、抑制炎症、促进血管新生，为糖尿病慢性伤口治疗提供了协同增效新策略。

　　

引言

糖尿病伤口作为糖尿病最常见的并发症之一，其愈合过程受到血管生成受损、慢性炎症和持续缺氧等多重因素的严重阻碍。高血糖、过度炎症、缺氧和氧化应激共同构成了复杂的伤口微环境，破坏了正常的愈合阶段（止血、炎症、组织形成和组织重塑）。其中，活性氧（ROS）的积累会损伤健康细胞和微血管，加剧慢性缺氧状态，而缺氧又会抑制细胞自我修复机制，最终导致细胞凋亡和坏死。因此，通过调节血糖和炎症反应来改善伤口微环境、缓解氧化应激和缺氧，成为糖尿病伤口治疗极具前景的策略。

材料与方法

本研究成功合成了具有释氧能力的多功能纳米粒子QP@Ca-E。首先通过化学沉淀法制备过氧化钙（CaO₂）纳米颗粒。随后，通过酰胺反应将2-甲酰基苯硼酸（FPBA）接枝到季铵化壳聚糖（QCS）上，形成QCS-FPBA。接着，利用QCS-FPBA封装CaO₂，得到QP@CaO₂，最后通过硼酸酯键与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）缀合，形成最终的QP@Ca-E纳米颗粒。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振氢谱（¹H NMR）证实了苯硼酸的成功接枝以及EGCG的锚定。透射电子显微镜（TEM）和能量色散X射线光谱（EDS）显示纳米颗粒形貌规整，元素分布均匀，粒径约100纳米。动态光散射和Zeta电位分析进一步验证了纳米颗粒的尺寸和表面电荷变化。氧释放曲线表明，与未封装的CaO₂相比，QP@Ca-E能有效减缓氧气的突释，实现超过5天的持续氧气释放。

水凝胶载体系统通过紫外光（UV）引发交联制备。首先，通过酰胺反应将4-戊烯酸（PA）和硫辛酸（LA）分别接枝到明胶（Gelatin）上，得到GP和GL。¹H NMR和FTIR证实了双键和双硫键的成功引入。将GP、GL与光引发剂Irgacure 2959混合，经UV照射后形成GP-GL双网络水凝胶。扫描电子显微镜（SEM）显示水凝胶具有多孔的三维结构，GP-GL水凝胶的孔径比GP水凝胶更小，表明多重交联形成了更致密的网络。元素 mapping 证实纳米颗粒在水凝胶中分布均匀。

结果与讨论

纳米粒子与水凝胶的表征

QP@Ca-E纳米粒子的成功合成通过多种表征手段确认。FTIR光谱中1126 cm^?1处的B-O吸收峰以及1458 cm^?1处EGCG芳环的C=C伸缩振动峰是关键证据。TEM图像显示CaO₂和QP@CaO₂粒径约为50纳米，而QP@Ca-E粒径超过100纳米。EDS谱图显示了Ca、C、N、O元素的均匀分布。Zeta电位分析表明，CaO₂带负电，经QCS封装后转为正电（QP@CaO₂），而EGCG缀合后因硼酸酯键形成和酚羟基解离又恢复负电性。氧释放实验证明QP@Ca-E能有效延缓CaO₂的水解，第5天时CaO₂的氧释放率超过80%，而QP@CaO₂仅为37.16%，实现了氧气的持续供应。pH监测显示，反应初期pH升高（Ca(OH)₂生成），随后因EGCG氧化产物及明胶降解产生的酸性基团积累而下降。

水凝胶的ROS/葡萄糖响应性通过EGCG的释放行为评估。在不同浓度H₂O₂（模拟ROS）或高葡萄糖条件下，EGCG的累积释放量显著增加，在10 mM H₂O₂时超过80%，证实了其双重响应特性。

抗氧化与抗菌性能

DPPH自由基清除实验表明，GP-GL@Ca-E水凝胶具有最强的抗氧化能力，清除率达到80.98 ± 3.40%，这归因于LA和EGCG的协同作用。抗菌实验显示，GP-GL@Ca-E能有效抑制大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的生长，菌落计数显著减少，证明了其良好的抗菌性能。

生物相容性

细胞毒性实验（CCK-8法）和活/死细胞染色表明，GP-GL@Ca-E水凝胶提取物对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）无毒性，并能促进细胞增殖。在模拟糖尿病高糖/缺氧（HG/hypoxia）损伤条件下，水凝胶处理能显著恢复细胞活力。细胞骨架染色（FITC-phalloidin）显示水凝胶提取物处理的HUVEC细胞骨架结构完整，铺展面积增加。

细胞迁移与体外血管生成

划痕实验和Transwell迁移实验表明，在高糖/缺氧模型下，GP-GL@Ca-E水凝胶能显著促进HUVEC的迁移和招募能力。体外血管形成实验（Tube formation assay）显示，GP-GL@Ca-E处理组能有效恢复因高糖/缺氧而受损的血管网络形成，增加管腔长度和分支数量，证明其强大的促血管生成能力。

ROS清除与抗炎作用

使用DCFH-DA探针和Ru(dpp)₃Cl₂缺氧探针检测发现，GP-GL@Ca-E水凝胶能有效清除细胞内ROS并缓解缺氧状态。在巨噬细胞极化实验中，脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞M1型极化（高表达CD86和iNOS）被水凝胶处理逆转，M2型标志物（CD206和Arg-1）表达上调，表明其能促进抗炎的M2型巨噬细胞极化。qPCR分析进一步显示，水凝胶处理能下调炎症趋化因子CCL2和CXCL2的表达，减轻炎症反应。

体内糖尿病伤口愈合

在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型中，GP-GL@Ca-E水凝胶治疗组在第14天时伤口愈合率达到99.01%，显著高于模型组的86.32%。组织学分析（H&E和Masson染色）显示，水凝胶治疗组炎症浸润减轻，上皮厚度增加，胶原沉积更致密、排列更有序。免疫组织化学（IHC）染色表明，水凝胶治疗能显著降低促炎因子（IL-6, MMP9, TNF-α）的表达，提高抗炎因子IL-10的水平。免疫荧光（IF）染色显示，治疗组伤口组织中CD31（血管内皮标志）和α-SMA（肌成纤维细胞标志）的表达显著增强，证明了其促进血管新生和伤口收缩的能力。

结论

本研究成功开发了一种基于ROS/葡萄糖双重响应的多功能释氧纳米复合水凝胶（GP-GL@Ca-E）。该系统通过智能响应伤口微环境，实现EGCG的控释和氧气的持续供应，有效缓解缺氧、清除ROS、调节炎症（促进M2型巨噬细胞极化）并促进血管新生。体内外实验证实，该水凝胶具有良好的生物相容性、抗氧化、抗菌和促愈合能力，能显著加速糖尿病伤口的修复过程。这项工作为慢性糖尿病伤口的临床治疗提供了一种新颖且具有广阔应用前景的策略。