缺氧与失巢凋亡相关LncRNA特征揭示肝癌分子亚型并预测预后及免疫治疗应答

《Journal of Hepatocellular Carcinoma》：Hypoxia- and Anoikis-Related lncRNA Signature Defines Molecular Subtypes and Predicts Prognosis and Immunotherapy Response in Hepatocellular Carcinoma

本文系统探讨缺氧与失巢凋亡相关长链非编码RNA（lncRNA）在肝细胞癌（HCC）中的预后预测价值及免疫调控作用。研究通过整合TCGA与GEO数据库数据，构建了基于9个关键lncRNA（如LINC01554、FIRRE等）的分子分型体系，发现C1亚型具有更强的免疫抑制特性（Tregs、M0巨噬细胞富集）和较差的免疫治疗反应，而C2亚型则呈现代谢相关特征和更好的预后。实验验证表明LINC01554与LINC01139在缺氧-失巢凋亡模型中分别发挥抑癌和促癌作用。该研究为肝癌精准免疫治疗提供了新型生物标志物和分型策略。

　　

引言

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其高复发率和转移性是临床治疗面临的主要挑战。在肿瘤进展过程中，缺氧（Hypoxia）和失巢凋亡抵抗（Anoikis Resistance）是两种关键的应激反应，分别通过调节肿瘤微环境（TME）和促进细胞在脱离细胞外基质（ECM）后的存活，显著影响HCC的侵袭和转移。长链非编码RNA（lncRNA）作为长度超过200个核苷酸的转录本，在肿瘤生物学中扮演重要角色，但其在缺氧-失巢凋亡交叉调控网络中的作用尚不明确。本研究旨在系统分析缺氧与失巢凋亡相关lncRNA在HCC中的表达特征，构建分子分型体系，并评估其预后预测价值及免疫治疗应答意义。

材料与方法

研究利用TCGA GDC API和GEO数据库（GSE188608、GSE103581）的RNA-seq数据及临床信息，筛选出154个与缺氧和失巢凋亡相关的lncRNA。通过ConsensusClusterPlus包进行一致性聚类分析，将HCC患者分为C1和C2两种分子亚型。差异表达分析采用limma包，预后模型构建采用LASSO Cox回归和逐步多变量回归分析。免疫浸润评估使用CIBERSORT、ESTIMATE和ssGSEA方法，免疫治疗敏感性通过TIDE和Immunophenoscore（IPS）预测。实验部分采用人HCC细胞系Li-7，在低氧（1% O₂）和超低吸附培养条件下建立缺氧-失巢凋亡模型，通过RT-qPCR、Western blotting、siRNA干扰和流式细胞术验证关键lncRNA的功能。

结果

分子亚型鉴定与预后分析

基于25个缺氧-失巢凋亡相关lncRNA的表达谱，TCGA-LIHC队列被分为C1和C2两种亚型。生存分析显示C1亚型患者总生存期（OS）显著差于C2亚型。免疫亚型分析表明，C1亚型中炎症性（C3）和淋巴细胞耗竭型（C4）比例较高，而C2亚型更富集于免疫活跃亚型（C1和C2），与其较好的预后一致。

基因组与免疫微环境特征

C1亚型表现出更高的基因组不稳定性，包括基因组改变分数（Fraction Genome Altered）和同源重组缺陷（HRD）评分升高。体细胞突变分析显示C1亚型TP53突变频率较高，而C2亚型则富集BIRC6等基因突变。免疫浸润分析发现C1亚型具有更高的基质评分（StromalScore）和免疫评分（ImmuneScore），但同时伴随免疫抑制细胞（如Tregs、M0巨噬细胞和MDSC）的富集。相反，C2亚型显示出更高的免疫激活状态和较低的TIDE评分，提示其对免疫检查点抑制剂（ICI）可能更敏感。通路富集分析表明C1亚型与E2F靶标、G2M检查点和上皮-间质转化（EMT）等增殖相关通路激活有关，而C2亚型则富集于胆汁酸代谢等代谢通路。

9-lncRNA预后模型的构建与验证

通过LASSO Cox回归筛选出9个关键lncRNA（LINC01554、LINC01134、LINC00661、LINC01096、MIAT、NBAT1、PICSAR、FIRRE和LINC01139），构建风险评分模型。高风险组患者OS显著缩短，且风险评分与肿瘤分级和AJCC分期呈正相关。多变量Cox回归确认风险评分是独立的预后因素。Nomogram整合风险评分和AJCC分期后显示出良好的预测准确性。在独立验证集GSE43619中，该模型同样展现出稳定的预后分层能力。

免疫治疗与药物敏感性预测

低风险组具有更高的IPS评分和更低的TIDE评分，表明其可能从免疫治疗中获益。药物敏感性分析提示高风险组对BI-2536等药物更敏感，而低风险组对Roscovitine等药物反应更好。风险评分与IFN-γ反应、TGF-β反应和非整倍体评分显著相关，进一步揭示了其与免疫微环境的密切联系。

实验验证

在Li-7细胞缺氧-失巢凋亡模型中，RT-qPCR检测发现LINC01554表达下调，而LINC01139等lncRNA表达升高。siRNA干扰实验表明，敲低LINC01554可减少细胞凋亡，而敲低LINC01139则促进凋亡，提示二者在缺氧-失巢凋亡应激中分别发挥抑癌和促癌作用。

讨论

本研究首次整合缺氧与失巢凋亡相关lncRNA，建立了HCC的分子分型体系及预后模型。C1亚型 characterized by 基因组不稳定、免疫抑制微环境和增殖相关通路激活，与较差的预后和免疫治疗耐药相关；而C2亚型则表现出代谢重编程和相对较好的免疫活性。关键lncRNA如LINC01554和LINC01139在实验中显示出调控凋亡的功能，为其作为潜在治疗靶点提供了依据。该研究为HCC的精准分型、预后评估及免疫治疗策略优化提供了新的视角和工具。

局限性与展望

尽管本研究在多个队列中验证了模型的稳健性，但其临床适用性仍需前瞻性多中心研究进一步确认。关键lncRNA的具体调控机制（如通过PI3K/AKT或EMT通路）有待深入探索。未来可结合单细胞测序技术，在更精细的层面解析这些lncRNA在肿瘤异质性和免疫微环境调控中的作用。