靶向溶酶体损伤：杜氏肌营养不良症治疗新策略及其与基因疗法的协同增效作用

《SCIENCE ADVANCES》：Lysosomal damage is a therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy

本研究针对杜氏肌营养不良症（DMD）基因疗法疗效不足的难题，深入探讨了溶酶体膜透化（LMP）这一被忽视的病理机制。研究人员发现DMD患者及动物模型肌肉中存在显著的溶酶体损伤，其特征为Galectin-3（LGALS3）上调和溶酶体功能紊乱。研究创新性地将微肌营养不良蛋白（μDys）基因疗法与溶酶体保护性双糖海藻糖（TR）联合应用，在Dmdmdx-4Cv小鼠模型中显著改善了肌肉功能、组织病理及转录组异常。该成果发表于《SCIENCE ADVANCES》，为DMD的联合治疗策略提供了新思路。

　　

在影响年轻男孩的严重肌肉退行性疾病——杜氏肌营养不良症（DMD）的治疗领域，基因疗法近年来带来了曙光。科学家们尝试通过腺相关病毒（AAV）递送缩短版的肌营养不良蛋白（微肌营养不良蛋白，μDys），以期恢复肌肉功能。尽管临床研究显示出希望，但治疗效果仍不理想，患者的功能改善未能达到临床前研究的预期。这促使研究人员思考：除了机械支撑作用外，肌营养不良蛋白的缺失是否还触发了其他未被充分认识的细胞损伤机制，而这些机制可能是当前基因疗法无法完全纠正的？这些问题构成了本研究探索的起点。

为了回答这些问题，研究人员将目光投向了细胞的“回收站”——溶酶体。他们假设，DMD中观察到的胆固醇代谢紊乱可能与溶酶体功能受损有关。本研究系统地评估了DMD中溶酶体的状态，并探索了针对溶酶体损伤的联合治疗策略。相关成果发表在《SCIENCE ADVANCES》杂志上。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：利用免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察肌肉组织切片及原代成肌细胞中溶酶体标志物（如LAMP2）和损伤标志物（如LGALS3）的定位与表达；通过透射电子显微镜分析溶酶体的超微结构；采用蛋白质印迹（Western blot）和定量PCR（qPCR）技术检测相关蛋白和mRNA水平的变化；使用DQ-Red BSA和LysoTracker等探针评估溶酶体蛋白水解活性和酸化功能；通过体内动物实验（使用Dmd^mdx和Dmd^mdx-4Cv小鼠模型）评估基因疗法（AAV-μDys）和药物干预（海藻糖，TR）单独及联合使用的效果；并借助RNA测序（RNA sequencing）进行转录组学分析。研究还涉及了患者及GRMD犬模型的肌肉活检样本分析。

研究结果

LGALS3在肌营养不良肌肉中上调并与LMP相关

研究人员首先证实，LGALS3（Galectin-3）可作为肌肉细胞中溶酶体膜透化（LMP）的生物标志物。在Dmd^mdx-4Cv小鼠的肌肉中，LGALS3在mRNA和蛋白水平均显著上调，并且与溶酶体标志物LAMP2共定位，形成LAMP2⁺LGALS3⁺斑点，表明肌纤维内部存在明显的LMP。这种现象在DMD患者和GRMD犬的肌肉活检中也得到证实，说明溶酶体损伤在不同物种的DMD中具有普遍性。

肌营养不良肌肉中溶酶体结构和功能的改变

研究进一步发现，营养不良肌肉中的溶酶体在数量和形态上均发生改变。LAMP2蛋白表达增加，三维重建图像显示溶酶体数量增多、体积增大、分布更密集。电镜观察证实了营养不良肌肉中存在大量增大、电子致密的溶酶体。功能上，源自Dmd^mdx-4Cv小鼠的原代成肌细胞其溶酶体蛋白水解活性显著降低。这些结果表明营养不良肌肉存在严重的溶酶体应激和功能受损。

溶酶体膜透化随年龄持续存在，并且是不同肌营养不良的共同特征

研究发现，LMP并非暂时现象，在1岁龄的Dmd^mdx-4Cv小鼠肌肉中依然存在。此外，在肢带型肌营养不良R5型（LGMDR5）小鼠模型和患者肌肉中也检测到LAMP2⁺LGALS3⁺斑点，提示溶酶体损伤可能是多种肌营养不良的共同细胞扰动。

溶酶体膜损伤后恢复和再酸化的缺陷

通过使用溶酶体损伤剂LLOMe处理原代成肌细胞，研究人员发现，Dmd^mdx-4Cv来源的细胞在基础状态下就表现出更多的LGALS3斑点和更少的酸性溶酶体（LysoTracker信号减弱）。在LLOMe损伤后，野生型细胞能有效修复溶酶体膜并恢复酸性，而营养不良的成肌细胞则表现出恢复缺陷，提示其存在内在的溶酶体修复功能障碍。

Dmd^mdx-4Cv肌肉中内溶酶体损伤反应的激活

面对溶酶体损伤，肌肉细胞启动了补偿机制。包括溶酶体生物合成关键转录因子EB（TFEB）的部分核转位及其下游靶基因（如组织蛋白酶B和D）的上调。同时，ESCRT（内体分选复合体）介导的修复通路（如ALIX和CHMP4B募集至溶酶体膜）也被激活，试图修复膜损伤。

肌营养不良肌肉中溶酶体自噬增加和溶酶体-自噬体融合受损

研究评估了自噬状态。虽然LC3-II/LC3-I比值降低且SQSTM1/p62积聚提示自噬流整体受损，但针对损伤溶酶体的选择性自噬——溶酶体自噬（lysophagy）却显著增加（LC3B⁺LGALS3⁺斑点增多）。然而，溶酶体（LAMP2⁺）与自噬体（LC3B⁺）的共定位分析显示，自噬溶酶体（LAMP2⁺LC3B⁺）的比例在营养不良肌肉中下降，表明溶酶体-自噬体融合存在缺陷。这可能是导致自噬功能障碍的原因之一。

Dmd^mdx-4Cv小鼠的脂质扰动与受损的溶酶体系统相关

研究人员证实了营养不良肌肉中存在胆固醇积聚。高胆固醇饮食（HCD）会加剧Dmd^mdx-4Cv小鼠的肌肉纤维化和溶酶体损伤（LAMP2⁺LGALS3⁺斑点增多），而在野生型小鼠中影响较小，表明营养不良肌肉对胆固醇诱导的溶酶体损伤更为敏感。

LMP挽救因肌营养不良模型中基因治疗方式的不同而异

研究人员比较了不同基因治疗策略对溶酶体损伤的纠正效果。在Dmd^mdx小鼠中，即使高剂量的AAV-μDys基因治疗也只能部分减少LMP斑点。相比之下，在LGMDR5（Sgcg^-/-）小鼠模型中，递送全长γ-肌聚糖（SGCG）的基因治疗却能几乎完全纠正溶酶体损伤。这提示μDys基因疗法本身可能不足以完全逆转DMD中的溶酶体功能障碍。

TR介导的溶酶体校正改善了次优剂量下的微肌营养不良蛋白基因治疗（联合治疗设置）

鉴于μDys单药治疗效果有限，研究人员尝试了联合治疗策略。他们将次优剂量的AAV-μDys与具有溶酶体保护作用的双糖海藻糖（TR）联合应用于Dmd^mdx-4Cv小鼠。结果发现，与单用μDys或单用TR相比，联合治疗能更有效地改善肌肉功能（如抓力、体外收缩力）、减轻组织病理变化（如纤维化、炎症、肌纤维坏死），并显著纠正溶酶体损伤指标（LAMP2⁺LGALS3⁺斑点降至接近正常水平）。转录组学分析进一步表明，联合治疗使营养不良肌肉的基因表达谱更接近野生型，且对炎症、代谢等异常通路的校正效果优于单药治疗。

结论与讨论

本研究揭示了溶酶体损伤是DMD中一个此前未被重视的重要病理机制。在DMD患者、GRMD犬和mdx小鼠模型以及原代肌肉细胞中均证实存在溶酶体膜透化（LMP）和功能紊乱。这种损伤与胆固醇代谢紊乱相互作用，并随着年龄增长持续存在。研究的一个重要发现是，当前主流的μDys基因疗法不能完全纠正溶酶体损伤，而能够递送全长蛋白的基因疗法则在LGMDR5模型中显示出更好的纠正效果。这为DMD治疗策略的优化提供了关键见解。

研究的创新之处在于提出了靶向溶酶体损伤以增强DMD基因治疗疗效的联合治疗新思路。通过将μDys基因疗法与溶酶体保护剂海藻糖联用，在动物模型中实现了功能、病理和分子层面的协同改善。这一“鸡尾酒疗法”策略有望克服单一疗法的局限性，为提升DMD临床治疗效果开辟了新的途径。未来，进一步探究溶酶体损伤的初始诱因、明确其在不同类型肌营养不良中的普遍性、优化联合治疗的时机和剂量，以及探索其他溶酶体靶向药物，将推动该领域向临床转化迈进。