线粒体Hsp60-Hsp10伴侣蛋白复合物在折叠应激下的原位结构与功能研究

《SCIENCE ADVANCES》：In situ characterization of mitochondrial Hsp60-Hsp10 chaperone complex under folding stress

本研究针对线粒体蛋白质稳态（proteostasis）在应激响应中的机制不明问题，利用冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术，在GTPP诱导的线粒体折叠应激模型中，揭示了mtHsp60-Hsp10复合物的空间聚集、构象重排及其与底物的原位互作细节，证实了该复合物通过维持线粒体蛋白质稳态来缓解应激，并阐明了其功能不足时激活线粒体自噬（mitophagy）的协同质量控制机制，为相关疾病机制研究提供了重要见解。

　　

线粒体被誉为细胞的“能量工厂”，但其功能远不止于此，它还深度参与细胞凋亡、信号传导等多种生命活动。为了维持这些复杂功能的正常运转，线粒体内部必须保持一个稳定、有序的蛋白质环境，即线粒体蛋白质稳态（mitochondrial proteostasis）。然而，当细胞遭遇各种压力（如热应激、氧化应激等）时，线粒体内的蛋白质容易发生错误折叠并积聚，破坏这种稳态，进而引发一系列问题，甚至导致癌症、心力衰竭和神经退行性疾病等多种疾病的发生。为了应对这种“折叠应激”（folding stress），细胞启动了一种名为“线粒体未折叠蛋白反应”（mitochondrial unfolded protein response, mtUPR）的防御机制，其中，上调表达一系列分子伴侣（chaperones）是核心策略之一。线粒体热休克蛋白60（mitochondrial heat shock protein 60, mtHsp60）及其辅助伴侣mtHsp10组成的复合物，是线粒体内最重要、最丰富的折叠机器之一，被认为在缓解折叠应激中扮演关键角色。然而，在真实的细胞环境中，当折叠应激发生时，这些伴侣蛋白复合物究竟是如何工作的？它们的空间分布、三维结构会发生怎样的变化？它们又是如何识别并帮助错误折叠的蛋白质“改邪归正”的？这些问题由于技术限制，长期以来缺乏直观的、在生理条件下的证据。

为了回答这些悬而未决的问题，一项发表在《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）上的研究，利用先进的冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography, cryo-ET）这一“原位”（in situ）结构生物学技术，如同给细胞内的线粒体做了一次高精度的“CT扫描”，首次在接近天然的状态下，清晰揭示了线粒体伴侣蛋白mtHsp60-Hsp10复合物在应对折叠应激时的动态行为和分子机制。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，他们建立了基于HeLa细胞（稳定表达Parkin-eGFP）的线粒体折叠应激模型，使用GTPP（gamitrinib-triphenylphosphonium）药物进行诱导。其次，他们采用了关联性冷冻荧光显微镜（cryo-fluorescence microscopy, cryo-FM）和冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技术，通过冷冻聚焦离子束扫描电镜（cryo-FIB/SEM）对目标细胞区域进行原位减薄，制备出适合cryo-ET观察的薄片（lamella）。然后，利用冷冻电子断层扫描采集海量的三维结构数据。最后，通过复杂的图像处理、三维重构、模板匹配（template matching）、亚断层图平均（subtomogram averaging）和三维分类（3D classification）等生物信息学方法，对线粒体内的超微结构、mtHsp60-Hsp10复合物的分布、构象及其与底物的相互作用进行了定性和定量分析。此外，研究还结合了基因敲低（knockdown）、免疫印迹（Western blot）、流式细胞术、免疫荧光等生化与细胞生物学实验进行功能验证。

研究结果

细胞冷冻电子断层扫描揭示折叠应激下线粒体内无定形蛋白聚集体的形成

研究人员通过GTPP处理诱导HeLa细胞发生线粒体折叠应激，观察到线粒体发生了明显的碎片化，并且与Parkin蛋白的募集点高度共定位，表明大部分线粒体确实处于应激状态。通过cryo-ET成像，他们首次在应激线粒体的基质中直接观察到了大量的、形态不规则的“无定形聚集体”（amorphous aggregates），这些聚集体与正常线粒体中常见的钙磷酸盐颗粒在形态和电子密度上均有区别。定量分析显示，这些聚集体在87%的应激线粒体中出现，占据了线粒体体积的4.2%。同时，线粒体内膜结构（嵴，cristae）的表面积也显著减少，表明其内部结构遭到了破坏。这些形态学变化共同证实了折叠应激对线粒体超微结构的深刻影响。

折叠应激重塑mtHsp60-Hsp10复合物的分子组织

在高倍率cryo-ET图像中，研究人员成功识别并定位了大量的mtHsp60-Hsp10复合物颗粒。他们发现，与未处理组和仅引起一般线粒体应激（不激活mtUPR）的CCCP处理组相比，GTPP诱导的折叠应激特异性地使mtHsp60-Hsp10复合物的丰度增加了约两倍，这与其通过mtUPR上调表达的预期一致。更重要的是，空间分布分析（Ripley‘s L函数）表明，在折叠应激下，这些复合物表现出更强的空间聚集性（clustering），提示它们可能通过协同作用来应对大量积聚的未折叠蛋白。此外，对复合物构象的分析发现，应激条件下，具有更高折叠活性的“足球状”（football）构象的比例显著增加，而“半足球状”（half-football）和“子弹状”（bullet-like）构象的比例相应变化。这表明，mtHsp60-Hsp10不仅通过增加数量，还通过调整自身的工作状态（构象）来增强其应对折叠应激的能力。

mtHsp60-Hsp10复合物足球状构象的原位结构分析

通过对从应激线粒体中提取的大量“足球状”mtHsp60-Hsp10复合物颗粒进行亚断层图平均，研究人员获得了分辨率达7.4埃（在D7对称性下）的三维结构。该结构清晰地展示了其经典的双环七聚体结构：每个环由7个mtHsp60亚基组成，顶部由一个七聚体的mtHsp10“盖子”覆盖。该原位结构与之前体外研究的结构高度相似，验证了其基本架构在生理环境下的可靠性。当研究人员放松对称性限制（C1对称）进行重建时，发现了环与环之间的相互作用存在不对称性，提示复合物内部存在动态的亚基间通讯。对ATP结合口袋的密度分析还表明，在生理条件下，并非所有14个核苷酸结合位点都被完全占据，这挑战了体外研究中常认为的需要饱和核苷酸才能形成功能复合物的观点，揭示了其功能的动态灵活性。

mtHsp60-Hsp10腔内封装底物的分子接触

为了解mtHsp60-Hsp10如何与待折叠的底物蛋白相互作用，研究人员对复合物内部的“折叠腔”进行了精细的分类分析。他们识别出三种主要状态：一个腔室被致密底物占据而另一个腔室底物稀疏；两个腔室均被致密底物占据；两个腔室均为稀疏底物。这表明该复合物能够同时利用两个腔室进行底物折叠。进一步对含有底物的复合物进行高分辨率结构解析，发现底物密度与mtHsp60亚基上高度保守的疏水残基（如Phe²⁷⁹, Tyr³⁵⁹, Trp⁴²）以及其非结构化的C末端尾部存在直接接触。这些相互作用位点与细菌同源物GroEL的研究结果一致，证实了mtHsp60-Hsp10通过其保守的疏水界面来捕获和稳定未折叠的底物蛋白，这是其发挥折叠功能的结构基础。

分子伴侣与线粒体自噬协同调控线粒体质量

功能验证实验表明，当敲低（knockdown）mtHsp60和mtHsp10的表达后，细胞在GTPP诱导的折叠应激下，不溶性蛋白组分显著增加，细胞活力下降，线粒体膜电位降低，活性氧（mtROS）水平升高，并且形成的蛋白聚集体体积更大，说明mtHsp60-Hsp10复合物的功能对于缓解折叠应激至关重要。同时，敲低细胞在受到应激时，Parkin蛋白向线粒体转运（mitochondrial translocation）的发生更早、更剧烈，随后线粒体蛋白的降解也更快。这支持了一个重要的生物学模型：在折叠应激初期，细胞通过mtUPR上调mtHsp60-Hsp10等伴侣蛋白来尝试修复损伤；一旦损伤超出伴侣系统的修复能力，细胞便会启动PINK1/Parkin介导的线粒体自噬（mitophagy），将严重受损的线粒体清除，以维持整体的细胞健康。

结论与意义

这项研究通过创新的原位结构生物学方法，首次在生理环境下系统性地揭示了线粒体关键伴侣蛋白mtHsp60-Hsp10复合物在应对蛋白质折叠应激时的动态响应机制。研究不仅直观展示了折叠应激导致的线粒体形态异常和蛋白聚集，更重要的是，发现了mtHsp60-Hsp10通过“量变”（丰度增加）和“质变”（空间聚集与构象重排）相结合的策略来增强其功能。其原位结构细节，包括不对称的环间相互作用、不完全的核苷酸占据以及保守的底物结合模式，为我们理解其在真实细胞环境中的工作机制提供了前所未有的细节。最后，研究通过功能实验证实了该复合物是维持线粒体蛋白质稳态的关键节点，并阐明了其功能失效后如何触发线粒体自噬这一“终极质量监控”途径。该研究极大地增进了我们对线粒体在应激条件下维持自身健康机制的理解，为开发针对线粒体功能障碍相关疾病（如神经退行性疾病、心脏病等）的新策略提供了重要的理论依据和结构基础。