海马颗粒细胞突触发育的动态基因调控网络解码

《SCIENCE ADVANCES》：A dynamic gene regulatory code drives synaptic development of hippocampal granule cells

本研究采用多组学方法，揭示了驱动海马齿状回颗粒细胞（GCs）突触发育的动态基因调控网络（GRNs）。研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单核多组学（snMO）分析和核糖体标记技术，构建了包含转录因子（TFs）、调控区域及其靶基因（TGs）的GRNs，发现早期和晚期出生后GRNs分别调控细胞形态发生以及突触组织和可塑性。功能缺失实验验证了Bcl6和Smad3作为关键TF，分别调控GCs突触前/后结构成熟、突触传递以及抑制性突触传递。该研究为理解神经元环路整合的分子程序提供了新见解。

　　

引言

神经元通过高度特化的细胞连接——突触，形成神经环路。神经环路的正确组装需要神经突的生长与导向、识别正确的细胞伙伴、形成突触连接，以及随后的突触成熟与可塑性。过去几十年，在识别调控环路组装各步骤的关键基因方面取得了重大进展，然而，这些单个基因的功能如何被协调以 orchestrate 神经元整合到功能环路中，仍不清楚。

基因调控网络（GRNs）由转录因子（TFs）、靶调控区域及其靶基因（TGs）组成，它将单个基因的行动协调成分子程序。对秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇神经系统发育中GRNs的分析提供了关键见解，这些研究提出了“终端选择器”假说，即持续表达的TF组合定义了细胞身份和关键细胞特性（如连接性）。小鼠神经系统中的研究也提供了证据，表明单个TFs通过调控轴突导向受体基因的表达，同时控制细胞身份和投射模式。这些研究暗示了细胞身份转录控制与连接模式之间的紧密联系。然而，对于调控突触接触形成、成熟和可塑性的GRNs，我们知之甚少，这可能由于哺乳动物神经系统突触发育所需时间漫长，以及突触前和突触后细胞之间的跨突触相互作用在决定突触特性中起关键作用等因素而复杂化。

本研究聚焦于海马颗粒细胞（GCs），这是一种在形态和连接性方面发育特征明确的细胞类型。GCs是海马三突触环路中的第一个中继站，接收来自内嗅皮层的兴奋性输入，并通过其苔状纤维 boutons（MFBs）向CA3锥体神经元提供兴奋性输入，在空间信息处理和记忆获取中起重要作用。已有研究通过功能缺失方法探讨了单个TFs在GC突触发育中的作用，例如，Sox11敲除（KO）严重破坏了GC轴突（苔状纤维，MFs）在CA3区的靶向，并改变了MF-CA3突触功能；Klf9缺失导致GC树突棘密度和长度短暂增加；Mef2c KO增加了内嗅皮层-GC突触的树突棘密度和突触传递；Bcl11b KO小鼠的GCs显示树突棘密度降低和MF靶向异常。最近，突触组织者C1QL2被鉴定为BCL11B的靶基因，为TF与GC突触结构和功能发育之间的因果联系提供了首个证据。然而，目前仍缺乏对驱动GCs突触发育的基因调控代码的全面分析。

本研究首先利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）绘制GCs在出生后发育过程中整合到海马三突触环路时突触基因表达的动态变化图谱。随后，利用单核多组学（snMO）分析，整合同一细胞的转录组和染色质可及性数据，重建GRNs。这揭示了一个动态的基因调控代码，包含调控细胞形态发生的早期出生后GRNs和调控突触组织与可塑性的晚期出生后GRNs。研究通过核糖体标记验证了TF和靶基因mRNA在GCs中被翻译。为了测试TFs在GC突触发育中的功能相关性，研究人员进行了功能缺失分析，鉴定出Bcl6作为树突棘密度、MFB形态和突触传递的调节因子，以及Smad3作为抑制性突触传递的调节因子。最后，基于研究结果构建了出生后GC发育的GRN模型，强调了早期出生后抑制性TFs如何靶向晚期出生后激活因子。这些发现揭示了支配GCs突触发育的动态基因调控代码，为关键TFs和靶基因提供了见解，并确定了Bcl6和Smad3作为GC突触发育特定方面的调节因子。

结果

单细胞转录组学分析揭示GCs中突触基因表达的动态变化

GCs整合到海马环路的结构过程已有详细描述。在小鼠中，GC的神经发生大约在出生时达到高峰，神经祖细胞（NPCs）产生神经母细胞（NBs），后者在出生后第3天（P3）左右转变为未成熟GCs（iGCs）。在此阶段，iGCs接收来自位于齿状回（DG）门区的苔藓细胞的兴奋性输入，并开始向CA3区延伸轴突。到P7时，iGCs发育为成熟GCs（mGCs），接收来自内嗅皮层的输入，并表现出一些轴突突起。到P14时，mGCs表现出增加的树突长度和棘密度，而CA3区的MFBs达到结构复杂性的峰值，随后发生突触重塑。到P28时，mGCs已达到其最终树突长度和完全发育的MFBs。此外，GCs在此发育期间开始接收来自不同类型GABA能神经元的抑制性输入。

为了绘制伴随的基因表达变化，研究人员在突触发育的关键时间点对Rbp4-Cre:Ai9小鼠的GCs进行了scRNA-seq。Rbp4-Cre系特异性在GCs中表达Cre重组酶，当与Ai9报告小鼠杂交时，导致tdTomato表达。在每个发育时间点，标记的GCs位于GC层的外侧部分，代表更成熟的GCs。通过荧光激活细胞分选（FACS）分选tdTomato阳性的GCs，并使用Smart-seq2进行单细胞测序，以检测每个细胞的高数量基因。使用交替的雄性和雌性样本以补偿性别相关差异，但P28时间点除外，该时间点同时分析了雄性和雌性样本。对雄性和雌性P28 scRNA-seq样本的差异表达分析仅显示少量差异表达基因（DEGs），表明在此阶段性别相关的转录差异极小。主成分分析（PCA）显示了清晰的基于年龄的细胞分离。分选的细胞表达了成熟GC标记基因Calb1以及其他GC和神经元标记物（Prox1, Rfx3, Slc17a7, Gad1）。

配对差异基因表达分析揭示了GCs在出生后发育过程中显著的基因表达变化，在P7和P15时存在突出的转变。随后对每个配对测试中排名前50的DEGs进行聚类，根据它们在伪时间上的基因表达谱显示了八个簇。接下来，通过分析这些簇中专家策划的SynGO数据库注释的DEGs，并将它们与使用基因本体（GO）分析（生物过程，BP）的每个簇的功能联系起来。在早期簇（簇1-2-3）中，发现了与轴突发生和蛋白质复合物组装调控相关的基因，如Gap43和Ncam1，以及Dpysl2和Dpysl3，这些是胞质磷蛋白，在发育神经元中参与生长锥崩溃和其他关键功能。簇3包含Efnb3，一种轴突导向线索。中间簇（簇4-5-6）包含与囊泡介导运输（例如Apba2和Ap2m1）以及与学习和记忆相关的基因。最后，晚期簇（簇7-8）包含在P15至P28左右表达达到峰值的基因，这些基因参与突触组织，如突触后细胞粘附分子Nlgn3，以及突触可塑性，如分泌型突触组织者Nptx1。该分析揭示了GCs在环路整合过程中突触基因表达的动态变化，存在一个与细胞形态发生相关的早期出生后阶段（P5至P7）和一个调控突触组织与可塑性的晚期出生后阶段（P15至P28）。

单核多组学（snMO）分析揭示GCs出生后发育过程中的GRN动态

为了绘制出生后GC发育过程中观察到的突触基因表达动态变化背后的GRNs，研究人员生成了P5、P10、P15和P28野生型（WT）小鼠海马的10x snMO数据集。来自同一细胞核的联合转录组和染色质可及性数据使得能够重建增强子驱动的调节子（eRegulons），包括TFs、它们的靶调控区域和靶基因。经过测序和质量控制后，对细胞类型进行注释，并使用标记基因提取GC谱系细胞核。NPCs存在于DG的颗粒下区，是最不成熟的细胞，基于Cdk6和Top2a表达进行鉴定。它们按时间顺序依次为1型NBs（表达Elavl2和Calb2）和2型NBs（表达Rgs6）。2型NBs产生iGCs（标记为Pcdh15和Prox1表达），最后是mGCs，即DG的主要兴奋性神经元，表达Meg3、Calb1和Ntng1。标记基因和相似性分析（使用余弦度量）证实，该数据集中的mGCs与我们scRNA-seq数据集中的GCs（由Rbp4-Cre:Ai9标记）最为一致。每个年龄显示不同比例的细胞类型，P5时NPCs比例较高，P28时mGCs比例较高。基于转录组和表观基因组谱的均匀流形近似与投影（UMAP）描绘了从NPCs到mGCs的转变。

聚焦于mGCs，研究人员分析了snATAC-seq数据以追踪随时间推移的染色质可及性变化。关注连续发育阶段之间的配对差异可及区域（DARs），观察到DARs与在不同阶段具有不同作用的基因相关。在P5和P10之间，与细胞命运决定相关的基因附近的DARs可及性降低，而与轴突发生或突触组织相关的基因 assigned 的区域可及性增加。从P15到P28，轴突发生相关基因附近的区域可及性降低，而与囊泡运输和信号转导相关的基因附近的区域可及性增加。这些发现与GC成熟和突触发育的时间进程一致。

接下来，使用SCENIC+推断GRNs。将SCENIC+应用于整个GC谱系，并重点关注在出生后发育过程中在mGCs中活跃的eRegulons。基于mGCs中SCENIC+ eRegulon富集分数（由AUCell计算的AUC分数）的PCA揭示了从P5到P28的清晰时间分离。在mGCs中鉴定出36个具有不同活性模式的eRegulons，其中主导TF的表达模式随时间推移与激活子的eRegulon活性相似，而与抑制子的模式相反。eRegulons根据活性模式分为三个主要簇。第一簇（簇1，早期）在P5高度活跃，包括Zbtb20(+)和Klf7(+)。第二簇（簇2，中期）在P10至P15达到峰值，之后下降，包括Bcl11b(+)、Foxo1(+)、Bcl6(+)和Atf6(+)。第三簇（簇3，晚期）在P15至P28达到峰值，包括Smad3(+)以及抑制子Bach2(?)和Nfib(?)等。

接下来，研究人员探索了mGCs突触发育过程中eRegulon活性模式是否与靶基因功能相对应，使用GO分析（BP）。Klf7(+)靶标与轴突发生相关，与Klf7在促进轴突生长中的作用一致。Bcl11b(+)调控参与膜电位和突触组织的靶基因，与Bcl11b在DG中的作用一致。Smad3(+)靶基因对突触可塑性和离子运输很重要，与Smad3在GCs长时程增强（LTP）中的作用一致。NFIB抑制子的靶基因参与突触传递和膜电位，这与它们在P5时表达被抑制的事实一致。类似地，Bach2(?)靶基因与可塑性和突触组织相关。在18个在DG中没有已知作用的eRegulons中，Bcl6(+)靶标与蛋白质定位到细胞外周相关，而Atf6(+)控制参与突触处囊泡运输的基因。这些发现揭示了一个动态的基因调控代码，由已知和未知的GRNs组成，orchestrating mGCs的出生后发育。

预测的TFs及其靶标在发育中的GCs中被翻译

接下来，研究人员确定了已鉴定的TFs和靶基因是否在GCs中被翻译，考虑到细胞转录组与蛋白质组之间的复杂关系。为此，使用核糖体标记分析被招募用于翻译的TFs和靶基因的转录本，并将这些与snMO分析的推断相关联。将RiboTag小鼠（在存在Cre重组酶的情况下表达血凝素（HA）标记的核糖体亚基Rpl22）与Rbp4-Cre系杂交，以在出生后阶段P5至P28捕获GCs中核糖体结合的mRNA。海马解离后，提取核糖体结合的mRNA，并在质量控制后进行批量RNA-seq。PCA显示从P5到P28的样本之间存在清晰的时间分离，P21和P28阶段几乎无法区分。差异基因表达分析再次揭示了在P7和P15时的显著转变，其中五个簇包含SynGO注释的基因。

使用该数据集，研究人员分析了在mGCs中主导SCENIC+预测的eRegulons的TFs的核糖体结合转录本表达模式。这些TFs的核糖体结合mRNA水平在很大程度上与它们在snMO数据集中的表达模式相关。例如，TFs如Nfib或Klf7在P5至P7达到峰值，之后下降，而其他TFs，包括Bcl6、Atf6和Smad3，在P15后表现出急剧增加。类似地，在GC连接性发育中具有先前表征作用的TFs，Bcl11b和Klf9，在翻译组谱和snMO数据集中的表达模式相匹配。

接下来，评估了RiboTag数据集中的eRegulon靶基因。通过分析靶基因随时间的平均表达，观察到核糖体结合的转录本水平与snMO数据集中的表达模式之间存在相似的表达谱。例如，Klf7(+)、Bcl11b(+)、Smad3(+)和Bcl6(+)靶基因的核糖体结合mRNA水平与它们在snMO数据集中的表达模式相关。因此，核糖体结合的TF和靶基因转录本动态与预测的eRegulon活性模式显示出强相关性，增加了对调控GCs出生后发育的已鉴定GRNs的信心。

GCs中Bcl6的缺失改变树突棘密度和MFB形态

为了测试已鉴定GRNs在GCs突触发育中的功能相关性，研究人员聚焦于来自中期和晚期簇（簇2和簇3）的eRegulons，因为它们的活性与GC突触形成、精细化和成熟的时间相吻合。选择了两个GRNs，Bcl6(+)和Smad3(+)，基于它们预测的靶基因的作用以及它们的主导TFs在GC突触发育中的未知作用。聚焦于这些，研究人员结合GCs的稀疏、明亮标记进行了相应TFs的功能缺失分析。

首先研究了Bcl6(+)，一个来自簇2（中期）的eRegulon，其活性在P15达到峰值。Bcl6本身先前未与突触发育相关联，并且在DG中没有已知作用。在皮层中，BCL6通过抑制Notch和Wnt通路促进神经发生。在DG中，Bcl6在祖细胞和iGCs中未检测到，但在mGCs中表达。在Rbp4-Cre:Ai9小鼠中，使用单分子荧光原位杂交在P15的GCs中检测到Bcl6 mRNA，但在P5时未检测到，与Bcl6(+) eRegulon活性一致。Bcl6(+)包括23个编码主要具有突触定位的蛋白质的靶基因，这些基因与海马突触发育相关。其中一个预测的BCL6靶基因是Nptx1，编码一种分泌型突触组织者，在MF-CA3突触处高度富集，并调控AMPA受体的聚集。Nptx1受一个在P28可及性达到峰值的染色质区域控制。

为了探索Bcl6在GCs突触发育中的作用，使用了短发夹RNA（shRNA）介导的Bcl6敲低（KD），结合flippase（FLPo）进行Supernova介导的稀疏标记。该系统依赖于四环素反应元件（TRE）启动子的泄漏，诱导四环素反式激活因子（tTA）表达，从而在稀疏细胞群体中增强信号。尝试验证Bcl6引导RNA（gRNAs）用于CRISPR-Cas9介导的KO未成功，原因是缺乏特异性BCL6抗体。因此，求助于先前验证的Bcl6 shRNAs，并在原代神经元中确认了其效率。将表达scrambled或Bcl6 shRNAs结合FLPo的腺相关病毒（AAVs）在P0注射到C57Bl/6J小鼠的DG中。P0 AAV9注射优先靶向有丝分裂后GCs，这些GCs将在P28时成为最成熟的GCs。在P28时，对GC树突和轴突片段进行成像并在3D中重建以进行形态分析。与表达scrambled shRNA的GCs相比，Bcl6 KD导致树突棘密度降低20%。这种减少是由成熟蘑菇棘密度的降低引起的。

接下来，分析了MFB面积、体积以及丝足数量和长度。MFBs包含一个或多个丝足，通过与抑制性神经元的突触介导向CA3神经元的feedforward抑制。Bcl6 KD导致每个MFB的丝足数量增加64%，而不影响丝足长度。Bcl6 KD动物的MFB面积和体积保持不变。

然后，使用急性海马切片中的全细胞电压钳记录，在注射了表达Bcl6或对照shRNAs的AAVs的C57Bl6J小鼠（P27至P35）中记录了GCs的自发性突触传递。与对照组相比，Bcl6 KD细胞中微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）的频率降低了40%，而mEPSC振幅保持不变。同样，与对照组相比，Bcl6 KD细胞中微型抑制性突触后电流（mIPSCs）的频率降低了45%，而mIPSC振幅保持不变。Bcl6 KD细胞中的兴奋/抑制比率与对照组相似。总之，这些结果表明，GCs中Bcl6的缺失改变了树突棘密度和MFB形态，并降低了自发性兴奋性和抑制性突触传递的频率。

GCs中Smad3的缺失改变抑制性突触传递

接下来，研究人员聚焦于Smad3(+) eRegulon，一个簇3（晚期）eRegulon，其活性在P28达到峰值。与此一致，使用单分子荧光原位杂交在Rbp4-Cre:Ai9小鼠的P15和P28的GCs中检测到Smad3 mRNA，但在P5时未检测到。预测SMAD3通过649个染色质可及性区域调控224个与突触发育相关的基因，这些区域的可及性从P5到P28逐渐增加。其中一个预测的SMAD3靶基因是Tanc1，一种支架蛋白，在海马中高表达，与兴奋性突触后支架PSD-95相互作用。其缺陷导致CA3区棘密度降低。Tanc1受一个在P28可及性达到峰值的染色质区域控制。

为了评估Smad3缺失是否影响GC树突棘密度或MFB形态，使用了CRISPR-Cas9介导的KO。体外验证证实Smad3 gRNAs在原代皮层培养中有效降低了SMAD3蛋白水平。将Rbp4-Cre小鼠与Cre依赖的Cas9小鼠（Rosa26-LSL-Cas9）杂交，用于GC特异性Smad3 KO，结合AAV-DIO-FLPo以实现Supernova介导的稀疏标记。这里，采用了用于Bcl6 KD实验的策略，使得FLPo表达的随机激活仅发生在Rbp4-Cre阳性细胞中。将表达Smad3靶向gRNAs或非靶向（lacZ）gRNA作为对照的AAVs注射到P7的Rbp4-Cre:Rosa26-LSL-Cas9小鼠的DG中，并在P28分析GC形态。Smad3 KO GCs中树突棘的密度和形态与对照GCs没有差异。此外，对MFBs面积、体积以及丝足数量和长度的分析未显示Smad3缺失后的显著变化，表明GCs中Smad3 KO不影响树突棘密度或MFB形态。

先前的研究表明，Smad3的缺失通过增强GABA_A受体神经传递废除了GCs中的LTP。使用全细胞电压钳记录在急性海马切片中记录了来自注射了表达Smad3或lacZ gRNAs的AAVs的Rbp4-Cre:Rosa26-LSL-Cas9小鼠（P27至P31）的GCs的自发性突触传递。Smad3 KO细胞中mEPSCs的频率和振幅与对照组没有差异。