PIEZO1在静息与激活状态下的纳米构象多样性及细胞微环境调控机制研究

《SCIENCE ADVANCES》：Cluster nanoarchitecture and structural diversity of PIEZO1 at rest and during activation in intact cells

本研究利用3D-MINFLUX纳米显微镜技术，首次在完整细胞中揭示了机械敏感离子通道PIEZO1在静息和激活状态下的纳米结构多样性。研究人员发现PIEZO1在细胞膜上形成独特的坑状内陷结构，并证明细胞骨架通过调控膜变形能力影响PIEZO1构象，该发现为理解机械信号转导的微环境调控提供了新视角。

　　

在细胞生物学领域，机械敏感离子通道PIEZO1作为机械力感知的关键分子，其功能异常与多种疾病密切相关。然而，由于技术限制，科学家们对PIEZO1在天然细胞环境中的真实构象及其调控机制知之甚少。传统冷冻电镜研究需要在人工膜系统中进行，这种简化模型无法还原细胞内的复杂微环境。更关键的是，PIEZO1在多种细胞类型中会形成显著簇集，但这些簇集的纳米结构及其功能意义仍待阐明。

为突破这些局限，研究团队运用前沿的3D-MINFLUX纳米显微镜技术结合DNA-PAINT方法，首次在完整细胞中对PIEZO1进行纳米级精确定位。该研究主要采用以下关键技术：3D-MINFLUX超分辨显微成像实现纳米级空间定位；DNA-PAINT技术提供单分子水平检测精度；通过基因工程构建ALFA标签和mGreenLantern标记的PIEZO1变异体；使用Yoda1化学激活剂和低渗应激模拟机械刺激；采用全细胞膜片钳和钙成像进行功能验证。

PIEZO1 conformation at rest differs between subcellular compartments

研究发现PIEZO1在神经元胞体和神经突两种不同细胞区室中呈现显著构象差异。通过测量叶片间距这一构象指标，发现神经突中的PIEZO1更倾向于收缩构象（20.3±4.9 nm），而胞体中的通道更为舒展（22.7±5.6 nm）。这种构象差异与机械敏感性相关，神经突表现出更高的Yoda1敏感性。

Local differences in cytoskeletal rigidity govern PIEZO1 conformation

研究人员通过细胞松弛素D（cytochalasin-D）破坏细胞骨架，发现这能显著改变PIEZO1构象分布，使其更类似于神经突中的状态。实验表明细胞骨架通过调控膜变形能力来影响PIEZO1构象，而非膜曲率或通道拥挤度等因素。

PIEZO1 adopts discrete conformations in its native environment

通过高斯混合模型分析，研究发现PIEZO1在天然环境中采取离散构象状态而非连续变化。这些状态与已知冷冻电镜结构高度吻合，包括弯曲状态（可能带有不同数量的"握手"相互作用）以及部分扁平化和完全扁平化状态。

PIEZO1 forms clusters that mediate local calcium influx

研究证实内源性和重组表达的PIEZO1均会形成功能簇集。通过PIEZO1-jGCaMP8m融合蛋白的钙成像实验，发现这些簇集在Yoda2刺激下能产生局部钙信号，证明其功能活性。

PIEZO1 clusters form pit-shaped invaginations in the plasma membrane

3D-MINFLUX成像首次揭示了PIEZO1簇集形成独特的坑状膜内陷结构。约63%的簇集呈坑状，平均深度144±60.1 nm，包含约23个通道。这些结构不同于经典的网格蛋白包被坑、小窝或COP1包被囊泡。

Hypoosmotic stimulation alters PIEZO1 cluster nanoarchitecture

低渗刺激引起坑状簇集结构改变，深度显著减小（110.7±54.8 nm）。高斯曲率映射显示更多通道暴露于凸面曲率，这种微环境变化可能促进通道激活。

研究结论强调，PIEZO1并非刚性开关，而是构象可塑的通道蛋白，其静息和激活状态受微环境物理特性动态调控。细胞骨架作为关键调节因子，通过纳米尺度的膜变形能力调控来影响PIEZO1构象。同时，PIEZO1簇集形成的坑状结构创造了独特的机械传导微环境，其中曲率梯度为机械信号转导提供了有利条件。这些发现为理解分区化机械传导提供了新框架，对揭示机械敏感性相关疾病的分子机制具有重要意义。该研究成果发表于《Science Advances》期刊。