冷冻电镜结构分析揭示CDC48解折叠酶的植物特异性适应机制

《Plant Communications》：Cryo-EM structural analyses reveal plant-specific adaptations of the CDC48 unfoldase

本研究针对植物CDC48介导的靶向蛋白降解机制不清的问题，通过冷冻电镜和生化分析揭示了拟南芥CDC48A与其辅因子UFD1和NPL4的独立结合特性，发现NPL4单独即可介导底物解折叠，这种解折叠机制的解耦揭示了植物蛋白降解机器的模块化进化祖先结构，为理解植物特异性适应提供了新见解。

　　

在生命世界中，蛋白质的精准降解对于维持细胞稳态和适应环境变化至关重要。作为真核生物中的"分子马达"，CDC48（细胞分裂周期蛋白48）在这一过程中扮演着核心角色，它通过水解ATP产生的能量，将泛素化标记的蛋白质解折叠并递送至蛋白酶体进行降解。然而，尽管CDC48在动物和真菌中的功能机制已有较多研究，但在植物这一重要生命类群中，CDC48系统如何适应其独特的生物学特性（如固着生长、环境胁迫响应等）却鲜为人知。

植物与动物、真菌在约十亿年前分化，虽然拟南芥CDC48A（AtCDC48A）与人类和酵母的同源蛋白具有高达80%的序列相似性，但植物在细胞结构、发育模式和应激响应等方面存在显著差异，这提示植物的CDC48系统可能发生了特异性适应。为了揭示这一科学谜题，Brandon Huntington等研究人员在《Plant Communications》上发表了他们的最新研究成果。

研究人员主要运用了冷冻电镜（cryo-EM）技术解析AtCDC48A及其与辅因子复合物的高分辨率结构，通过X射线晶体学辅助解析特定结构域，并采用多种生物物理和生化方法（如等温滴定量热法ITC、微量热泳动MST、尺寸排阻色谱-多角度光散射SEC-MALS）分析蛋白质相互作用，同时利用体外解折叠实验和ATP酶活性测定评估功能特性，结合AlphaFold2进行结构预测和进化分析。

研究结果

Idiosyncrasies of Arabidopsis CDC48A compared to animal and fungal orthologues

通过冷冻电镜解析了AtCDC48A在四种不同核苷酸状态下的结构：ADP结合状态（3.0 ?分辨率）、两种ATP类似物（AMPPNP）结合状态（AMPPNP-Up和AMPPNP-Down；3.2 ?和3.3 ?分辨率）以及无核苷酸的apo状态（3.9 ?分辨率）。研究发现，尽管AtCDC48A与动物和真菌同源物在结构上高度保守，但仍存在重要差异：AMPPNP结合的AtCDC48A明显呈现NTD向下的构象，这在动物和酵母同源物的冷冻电镜结构中较少见；AtCDC48A仅形成单一六聚体，而人类Hsp97在无核苷酸条件下可形成D2介导的十二聚体状态。

Structural dynamics of AtCDC48A

通过三维变异性分析（3DVA）揭示了AtCDC48A的动态特性：ADP结合状态异质性最低，apo状态显示中等异质性，而AMPPNP结合状态则表现出较高的异质性，特别是在NTD定位方面。分析发现NTD可在"向上"和"向下"构象之间连续转变，甚至出现三个NTD向上而另外三个向下的不对称状态。差异扫描荧光分析（DSF）显示，核苷酸游离的AtCDC48A热稳定性最低（Tm=50.5°C），而ADP结合状态最稳定（Tm=58°C）。ATP水解实验表明AtCDC48A的基础ATP转换率比人类Hsp97高35%。

Plant-specific connections between CDC48, UFD1 and NPL4

生物信息学分析发现，植物UFD1的NPL4结合基序（NBM）存在关键差异，缺乏第二和第三个疏水残基。AlphaFold预测支持CDC48-UFD1的相互作用，但不支持NPL4-UFD1在拟南芥和地钱中的相互作用。同时，植物NPL4缺乏动物和真菌中存在的锌指（ZnF）结构域，但保留了UBX样（UBXL）结构域。这些特征表明植物中NPL4和UFD1的相互作用模式与动物和真菌存在显著差异。

The Arabidopsis CDC48A--UFD1--NPL4(CNU) complex shows plant-specific independence of cofactors in vitro

实验验证表明，AtNPL4和AtUFD1不能形成稳定的异源二聚体，这与人类和酵母中的情况截然不同。ITC分析显示，AtCDC48A与AtUFD1B的相互作用KD值为3.1±1.1 μM，而与AtNPL4的相互作用KD值为3.0±1.0 μM，且结合化学计量约为一个辅因子对一个AtCDC48A六聚体。重要的是，AtNPL4单独即可与AtCDC48A结合，而不需要UFD1的参与，这与人类同源物中HsNpl4在没有HsUfd1的情况下不能与Hsp97结合形成鲜明对比。

体外解折叠实验证明，AtCNU复合物（而非单独的AtCDC48A）能够解折叠多聚泛素化的Eos底物，且速率明显快于Hsp97与AtNPL4和AtUFD1B的组合。尤为重要的是，AtNPL4单独就能使AtCDC48A解折叠泛素化底物，但两个辅因子的共同存在会产生协同效应，提高解折叠效率。

Structure of the AtCNU complex reveals plant-specific cofactor interactions

通过冷冻电镜解析了AtCNU复合物的结构（3.9 ?分辨率），发现AtNPL4通过其UBXL-MPN连接区与AtCDC48A的D1结构域相互作用，这一相互作用由AtNPL4的F105残基与AtCDC48A的疏水口袋之间的相互作用稳定。这种结合模式替代了动物和真菌中ZnF结构域介导的相互作用，代表了植物特异的适应机制。结构中未明确解析AtUFD1，可能由于其较短的相互作用基序位于本质无序区域，且能与六个NTD中的任何一个灵活结合。

Features of the AtCNU complex are conserved in plants and may be the ancestral form

进化分析表明，CDC48-UFD1的相互作用在所有具有UFD1 SHP基序的物种中都是保守的。然而，NPL4与CDC48的相互作用模式在进化上更具信息性：具有ZnF结构域的NPL4主要出现在后鞭毛生物（Opisthokonta）超群的高等真核生物中，这些生物还发展了直接的UFD1-NPL4相互作用；而没有ZnF结构域的NPL4则利用短的β链和α螺旋基序将MPN结构域锚定在D1上。在绿色植物（Viridiplantae）中，MPN锚定通过加入UBXL-MPN连接区相互作用而进一步加强。这些发现表明，CDC48与UFD1和NPL4的独立相互作用可能反映了真核生物祖先的状态。

研究结论与意义

本研究通过综合结构、功能和计算方法，首次系统揭示了植物CNU降解机器的分子架构。研究发现，植物CDC48系统保留了更大的模块化和组合性辅因子使用特性，其中NPL4和UFD1不形成 obligatory 异源二聚体，而是能够独立与CDC48结合，且NPL4单独即可启动底物解折叠过程。

这种植物特异性的适应机制可能为固着生长的植物提供了更大的调控灵活性，使其能够更好地应对环境挑战。CDC48在植物生长、萌发、开花、叶绿体调控和免疫等过程中的关键作用可能正是得益于这种模块化的辅因子使用策略。此外，植物UBX（PUX）家族辅因子可能与NPL4组合使用，进一步扩展了底物处理的选择性。

从进化角度看，本研究支持植物CDC48系统代表了一种更为祖先的真核生物状态，而动物和真菌中obligatory异源二聚体的形成则是衍生特征。这一发现不仅增进了我们对植物蛋白质量控制机制的理解，也为真核生物CDC48系统的进化提供了新的视角。

总之，这项研究揭示了植物CDC48解折叠酶的独特结构和功能特性，为理解植物如何通过特异性适应其蛋白降解机器来应对环境挑战提供了重要见解，对作物改良和植物生物技术具有潜在的应用价值。