METTL3介导染色质可及性与转录解耦联在视网膜发育中的新机制

《Stem Cell Reports》：METTL3 uncouples chromatin accessibility from transcription during retinal development

本研究揭示了METTL3通过m6A修饰调控视网膜发育的新机制。研究人员发现METTL3的核内催化活性对mESC向RPC分化至关重要，并通过GLORI、dCas13b-FTO等前沿技术证实Six3的3'UTR区域m6A修饰调控其稳定性。意外的是，METTL3虽能调节组蛋白修饰和染色质可及性，但其直接染色质靶点与转录变化无相关性，首次提出染色质可及性与转录解耦联的新范式。

　　

在生命科学领域，RNA修饰作为表观转录组学的重要研究方向，近年来受到广泛关注。其中N6-甲基腺苷（m6A）是最常见的mRNA修饰，约20%-40%的mRNA存在这种修饰。然而，m6A修饰在组织发育过程中与表观基因组的交叉对话机制仍知之甚少。

视网膜作为研究神经发育的理想模型，其发育过程受到精密调控。视网膜祖细胞（RPC）分化为特定视网膜细胞类型的过程涉及复杂的基因表达调控网络。先前研究发现表观遗传因子如组蛋白甲基转移酶辅因子WDR5能调控眼场转录因子（EFTFs）活性，但RNA甲基转移酶在视网膜发育中的作用尚未明确。

尽管研究表明斑马鱼中Mettl3敲低会导致小眼畸形，小鼠中Mettl3缺失会影响RPC向Müller胶质细胞的转变，但对METTL3的直接RNA靶点、染色质靶点以及表观转录组与表观遗传在视网膜发育中的相互作用仍缺乏系统研究。

研究人员利用小鼠胚胎干细胞（mESC）来源的视网膜类器官模型，结合多组学方法，深入探究METTL3在mESC向RPC分化过程中的功能机制。研究发现不仅揭示了METTL3通过m6A修饰调控RNA稳定性的经典功能，还发现了其非经典功能——调节染色质可及性但与转录输出解耦联的新现象。

研究采用的主要技术方法包括：全基因组m6A定量测序（GLORI）、蛋白质-DNA相互作用分析（ChIP-seq和CUT&RUN）、染色质可及性检测（ATAC-seq）、靶向m6A工程（dCas13b-FTO）以及基于降解子的METTL3快速降解系统。样本来源于Rx:GFP mESC系分化的视网膜类器官，通过时间序列分析追踪分化过程中的分子变化。

Enzymatic function of nuclear METTL3 controls the mouse embryonic stem cell-to-retinal progenitor cell(mESC-to-RPC) fate transition

研究人员首先构建了Mettl3敲除（KO）的Rx:GFP mESC系，并通过外源导入可诱导表达的HA-METTL3^WT进行回补实验。Western blot验证了内源性Mettl3的缺失和外源性METTL3^WT的重构。实验发现Mettl3^KO mESC在分化第6天无法形成Rx:GFP⁺ RPC，而METTL3^WT回补能恢复RPC分化。

时间进程RNA测序显示，Mettl3^KO类器官中 pluripotency基因（如Nanog）的丢失以及神经外胚层基因（Sox2、Otx2、Pax6）的诱导与野生型（WT）相当，但EFTFs基因（Lhx2、Six3、Rax）的诱导显著受损。这表明METTL3在视网膜神经外胚层分化中具有特异性作用。

为验证METTL3催化活性的必要性，研究人员构建了催化突变体（APPA、W475A和N477A），发现这些突变体均无法恢复Mettl3^KO mESC的RPC分化缺陷。细胞分馏实验证实METTL3在RPC的细胞质和细胞核中均有分布，而通过GRBD系统强制METTL3定位于细胞核（而非细胞质）才能恢复RPC分化。

METTL3 binding to chromatin is uncoupled from transcription in mESC-derived RPCs

通过CUT&RUN技术分析组蛋白修饰，发现Mettl3^KO RPC中H3K4me3修饰减少而H3K27me3修饰增加。ChIP-seq和CUT&RUN鉴定出314个METTL3特异性染色质结合峰，对应222个基因。然而，RNA-seq数据显示这些METTL3染色质靶基因在Mettl3^KO和回补组中转录水平无显著变化，表明METTL3的染色质结合与转录调控解耦联。

Genome-wide quantitative m6A mapping in mESC-derived RPCs reveals regulatory m6A modifications in EFTF RNA Six3 at 3'UTR

GLORI技术对第4天类器官进行全基因组m6A定量作图，发现WT和Mettl3^KO类器官分别含有28,689和11,881个高可信度m6A位点，其中27,832个为METTL3依赖性m6A位点。m6A主要分布在3'UTR（56.33%）和CDS（约40%），与既往研究一致。整合分析发现EFTFs转录本（如Lhx2、Six3、Rax）存在METTL3依赖性m6A修饰。

METTL3 regulates gene expression primarily through m6A-mediated RNA stability

RNA稳定性实验显示，催化突变体METTL3^APPA表达延长了METTL3调控mRNA的半衰期。通过dCas13b-FTO系统靶向去除Six3 3'UTR特定m6A位点（A1745、A1777、A1798）能增加Six3 mRNA水平，而CDS区域m6A去除（A789）无此效应，证明3'UTR m6A修饰调控Six3稳定性。

Acute METTL3 inactivation in RPCs reveals a regulatory METTL3-Ythdf1 protein-RNA interaction and leads to impaired retinal differentiation

eCLIP鉴定出2,584个METTL3靶RNA。利用dTAG-13诱导的METTL3快速降解系统发现，虽然染色质可及性（ATAC-seq）在METTL3降解后1、8、24小时无显著变化，但转录组（RNA-seq）出现快速改变。整合分析发现40个同时被METTL3结合、m6A修饰且在METTL3降解后上调的RNA，其中包括m6A阅读器Ythdf1。

Ythdf1/2/3三敲除（TKO）mESC在RPC分化中模拟了Mettl3^KO表型，而Dox诱导的YTHDF2回补能部分恢复RPC分化，表明METTL3-Ythdf轴在视网膜发育中的关键作用。

研究结论部分指出，METTL3作为主要m6A写入酶，通过独立于染色质可及性的机制调控mESC向RPC和RPC向视网膜的转录程序。研究发现METTL3缺失不影响多能性退出，但特异性损害眼场/视网膜标志物的获得。核定位信号（NLS）突变实验进一步证实核内METTL3催化活性对RPC分化的必要性。

讨论部分强调，本研究发现的METTL3介导的染色质可及性与转录解耦联现象，为表观转录组与表观基因组互作提供了新见解。dCas13b-FTO工程首次揭示Six3的3'UTR m6A修饰调控其稳定性，而急性METTL3降解模型揭示METTL3-Ythdf1蛋白-RNA相互作用的快速调控网络。尽管研究发现METTL3染色质靶点无转录功能，但不能排除METTL3通过间接方式影响染色质修饰的可能性。

该研究发表于《Stem Cell Reports》，通过多组学方法系统阐明了METTL3依赖性m6A修饰作为视网膜发育关键表观转录组层面的重要作用，揭示了染色质可及性与转录输出解耦联的新基因组范式，为理解组织发育中表观转录组调控机制提供了重要理论依据。