体外人类骨骼肌模型转录组特征与体内参照的系统性解析

《Stem Cell Reports》：Delineating transcriptomic signatures of in vitro human skeletal muscle models in comparison to in vivo references

本研究针对体外骨骼肌模型与真实肌肉组织差异不明的问题，通过整合分析39项研究的400余个转录组样本，系统比较了hPSC分化、成纤维细胞转分化等模型与胎儿/成人肌肉的转录组特征。研究发现体外模型存在肌生成因子表达缺失、表观记忆残留、脂代谢异常及FGF信号通路缺陷等问题，并首次揭示了3D类器官可诱导更深层次的卫星细胞静息状态。该成果为优化体外模型提供了分子靶点，对再生医学研究具有重要指导意义。

　　

在再生医学和疾病研究领域，能够准确模拟人体组织的体外模型至关重要。骨骼肌作为人体最大的器官，占体重的40%，不仅负责运动功能，还参与代谢调节和免疫反应。然而，现有的体外模型包括人多能干细胞（hPSC）分化、成纤维细胞转分化等方法，在模拟真实肌肉特性方面仍存在显著局限。这些模型普遍面临细胞成熟度不足、表观遗传记忆残留以及代谢特征异常等挑战，严重制约了其在疾病机制研究和药物筛选中的应用。

为了系统评估现有骨骼肌模型的可靠性，比利时鲁汶大学干细胞研究所的Margaux Van Puyvelde团队在《Stem Cell Reports》上发表了最新研究成果。研究人员创新性地整合了39项研究的400余个转录组数据集，涵盖bulk RNA-seq、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核RNA测序（snRNA-seq）数据，对2D/3D培养模型与真实人体肌肉组织进行了全面对比。

研究采用多组学整合分析方法，通过主成分分析（PCA）、差异表达基因（DEG）筛选、基因集富集分析（GSEA）等生物信息学技术，系统比较了不同模型与真实肌肉的转录组差异。特别值得注意的是，团队建立了严格的表达量过滤标准（上调基因CPM>5，下调基因CPM<1），确保发现的差异具有生物学意义而非技术偏差。

大规模RNA测序分析揭示体外模型与真实骨骼肌的差异

研究人员首先通过PCA分析发现，所有体外模型都与体内样本明显分离，且更接近胎儿肌肉而非成人肌肉。特别值得注意的是，转分化模型（TDMT）中早期肌生成调节因子MYF5和PAX7表达严重缺失，而关键的成熟期因子MYF6也未能正常表达。比较体外肌管模型（DMT和TDMT）与成人肌纤维（AMF）发现，两者共有570个下调基因重叠度超过60%，这些基因主要富集在横纹肌收缩、脂代谢等通路。

转录因子和表观复合体的异常表达

分析显示，HOX家族转录因子在体外模型中持续异常高表达，这可能与模型的空间模式识别缺陷有关。同时，β-连环蛋白（CTNNB1）和WWTR1在hPSC分化模型中表达水平显著高于体内样本，提示Wnt和Hippo通路活性异常。表观遗传分析发现，PRC1复合体核心组分（BMI1、CBX6等）在源细胞（hPSC和成纤维细胞）中高表达，且在分化后仍持续存在，表明表观记忆未被有效清除。

代谢稳态和纤维类型特征的失调

跨膜转运蛋白基因在体外模型中普遍差异表达，提示营养摄取机制异常。脂代谢分析显示，脂肪酸分解和磷脂酰胆碱合成通路基因显著上调，而胆固醇合成基因下调。纤维类型特征分析表明，体外模型更倾向于糖酵解代谢，且快肌纤维相关基因（如MYH1、MYH2）表达模式复杂，不完全符合单一纤维类型特征。

信号通路景观的改变

信号通路分析发现，FGF通路配体表达缺陷最为突出，10种FGF配体在体外模型中完全缺失，仅FGF5在转分化肌祖细胞（TDMB）中上调。同时，PI3K/AKT通路激活剂（SEMA4D、PEBP4）下调，而MAPK/p38通路成员（SHC3、MAPK11）上调，这可能与MYOD1过表达诱导的转分化过程相关。

PAX7⁺卫星细胞转录组特征的差异

通过整合6个scRNA-seq数据集，研究人员首次揭示了不同模型产生的PAX7⁺细胞存在静息状态连续谱系。3D类器官主要产生深度静息卫星样细胞（高表达CXCR4、CAV1），而2D分化模型则同时产生浅度静息细胞和增殖性发育祖细胞（高表达ERBB3、细胞周期基因）。值得注意的是，在增殖性祖细胞集群中发现了BRCA1-BRCA2复合体（BRCC）成员的特异性高表达，提示该复合体可能在肌源性命运决定中发挥新作用。

这项研究首次在系统水平上揭示了人类骨骼肌体外模型与真实组织之间的分子差异，为模型优化提供了明确靶点。研究发现的表现遗传记忆残留、代谢通路异常和信号分子缺失等问题，解释了当前模型成熟度不足的根本原因。特别是关于3D培养系统能够促进卫星细胞静息状态的发现，为建立更接近体内环境的肌肉干细胞模型提供了新思路。该研究建立的综合分析框架也可推广至其他细胞类型的模型评估，对再生医学领域具有重要的方法论意义。