LINC01612-DVL2-WNT轴通过稳定DVL2蛋白调控人内胚层分化的新机制

《Stem Cell Reports》：The LINC01612-DVL2-WNT axis promotes human endoderm differentiation

本研究揭示了位于基因荒漠区的长链非编码RNA LINC01612在人确定性内胚层分化中的关键作用。研究人员发现LINC01612通过直接结合WNT信号通路调节因子DVL2，减少其泛素化降解，从而增强WNT/β-catenin信号活性，促进内胚层分化。这一新发现的LINC01612-DVL2-WNT调控轴为理解胚胎早期发育和干细胞定向分化提供了重要机制见解。

　　

在胚胎发育的奇妙旅程中，细胞如何从多能状态精确分化为特定胚层是一个基础而迷人的科学问题。特别是内胚层的形成，它关系到未来肺、肝、胰腺等重要器官的发育，对再生医学研究具有重要意义。然而，尽管科学家们已经发现了一些调控因子，但位于基因组"荒漠区域"的长链非编码RNA(lncRNA)在内胚层分化中的作用仍知之甚少。

传统观点认为，基因通常成簇分布，但事实上人类基因组中存在大量基因稀少的"荒漠区域"。近年来研究发现，这些区域也能转录产生lncRNA，但它们的功能大多未知。更令人困惑的是，这些"荒漠lncRNA"往往表现出细胞类型特异性表达模式，暗示它们可能在特定发育阶段扮演重要角色。

为了解决这一知识空白，武汉大学的研究团队在《Stem Cell Reports》上发表了一项创新性研究，系统揭示了一个名为LINC01612的荒漠lncRNA在人内胚层分化中的关键作用及其分子机制。

研究人员采用的主要技术方法包括：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建LINC01612敲除的胚胎干细胞系；通过RNA干扰技术进行基因敲低；采用RNA pulldown和质谱分析鉴定LINC01612相互作用蛋白；使用蛋白质印迹和免疫荧光分析蛋白表达；通过RNA测序进行转录组分析；利用流式细胞术评估分化效率；以及通过泛素化实验分析蛋白质稳定性。

LINC01612是内胚层分化中高表达的非编码RNA

研究人员首先通过转录组分析发现，LINC01612在内胚层细胞中特异性高表达。时间进程分析显示，随着内胚层分化的进行，LINC01612表达逐渐上调。有趣的是，在人类组织表达数据库中，LINC01612在内胚层来源的组织如肝脏和肺中表达较高。

通过实验验证，研究人员发现LINC01612存在两种异构体，但主要功能形式是较长的1256核苷酸版本。尽管生物信息学预测显示LINC01612可能编码小肽，但进一步的实验证实它在内胚层分化背景下并不编码蛋白质，确认为真正的非编码RNA。

LINC01612缺失严重损害内胚层分化

为了探究LINC01612的功能，研究人员通过短发夹RNA(shRNA)敲低和CRISPR-Cas9介导的启动子删除两种策略，成功构建了LINC01612功能缺失的细胞模型。令人惊讶的是，LINC01612的缺失导致内胚层分化严重受损，具体表现为内胚层标志物SOX17、FOXA2、CXCR4的表达显著下降，而多能性基因如OCT4(POU5F1)和SOX2的表达反而上升。

RNA测序分析进一步证实，LINC01612敲除导致1000多个基因表达发生改变，其中内胚层分化相关通路显著富集在下调基因中，而干细胞多能性相关通路则在上调基因中富集。这些结果强有力地证明了LINC01612在内胚层谱系特化中的必要性。

WNT信号通路是LINC01612的功能下游

机制探索方面，基因本体(GO)分析提示WNT信号通路可能参与LINC01612的功能发挥。实验证实，LINC01612缺失确实导致WNT信号关键效应分子β-连环蛋白(β-catenin)的活性形式减少。更重要的是，当研究人员使用WNT信号激活剂CHIR-99021或Wnt3a处理LINC01612敲除细胞时，内胚层分化的缺陷得到明显挽救，这直接证明WNT信号通路位于LINC01612的下游。

LINC01612通过稳定DVL2蛋白增强WNT信号

那么LINC01612如何调控WNT信号呢？研究人员发现LINC01612主要定位于细胞质，这提示它可能通过转录后机制发挥作用。RNA pulldown结合质谱分析鉴定出DVL2(Dishevelled 2)是LINC01612的直接相互作用蛋白。DVL2是WNT信号通路的关键调节因子，能稳定β-catenin。

精细定位实验显示，LINC01612的201-600核苷酸区域与DVL2的DEP结构域直接结合。功能上，LINC01612并不影响DVL2的mRNA水平，但显著提高DVL2蛋白稳定性。进一步机制研究表明，LINC01612通过减少DVL2的泛素化，抑制其蛋白酶体降解途径，从而维持DVL2蛋白水平。

DVL2介导LINC01612的内胚层分化功能

为了确认DVL2在LINC01612通路中的关键地位，研究人员发现DVL2敲低同样损害内胚层分化，且转录组变化与LINC01612敲除高度重叠。更重要的是，在LINC01612敲除细胞中过表达DVL2，能够有效挽救内胚层分化的缺陷。

综合以上发现，研究人员提出了一个完整的工作模型：在内胚层分化过程中，LINC01612通过直接结合DVL2蛋白，减少其泛素化修饰，从而保护DVL2免受蛋白酶体降解。稳定的DVL2进而增强WNT/β-catenin信号通路活性，最终促进内胚层分化。

这项研究的创新性在于首次揭示了一个荒漠lncRNA通过调控蛋白质稳定性来影响信号通路和细胞命运决定的新机制。不仅深化了我们对lncRNA功能多样性的认识，也为理解胚胎早期发育提供了新的视角。从转化医学角度，这一发现可能为基于干细胞的器官再生和疾病建模研究提供新的靶点。

值得注意的是，LINC01612在不同生物学背景下可能发挥不同功能，例如在癌症中已报道其具有抑癌作用。这种细胞类型特异性正是lncRNA研究的魅力所在，也提示我们需要在具体生物学过程中理解lncRNA的功能。未来研究将探索LINC01612-DVL2-WNT调控轴在其他发育过程或疾病状态中的保守性，以及其作为潜在治疗靶标的可能性。