TGF-β、Wnt和MAPK信号通路在体外和离体关节谱系定向分化中的关键作用解析

《Stem Cell Reports》：The roles of TGF-β, Wnt, and MAPK signaling pathways in joint lineage specification in vitro and ex vivo

本研究针对关节发育初期祖细胞定向分化机制不明确的问题，通过构建双报告基因mESC模型，系统解析了TGF-β信号在Gdf5+关节祖细胞诱导中的核心作用，发现Wnt/MAPK信号抑制可协同促进关节谱系分化。单细胞转录组证实诱导细胞与胚胎肢芽关节组织高度相似，为关节疾病治疗提供了新的靶点策略。

　　

滑膜关节作为脊椎动物运动系统的关键结构，其发育机制一直是发育生物学研究的重点难点。尽管关节对机体功能至关重要，但关于关节发育起始阶段祖细胞如何分化为解剖和功能各异的关节组织（如关节软骨、半月板、韧带等）的分子机制仍不明确。这一科学问题的破解，对于理解关节发育异常相关疾病（如先天性关节畸形、骨关节炎等）具有重要意义。

以往研究虽通过基因敲除等技术发现TGF-β超家族成员、Wnt和FGF等信号通路可能参与关节发育，但这些体内研究存在细胞数量少、时间窗口短、技术成本高等局限。更重要的是，驱动Gdf5阳性细胞出现以启动关节发育的初始信号，以及这些信号是否能进一步诱导细胞分化为表达Prg4的关节腔内细胞，仍缺乏系统研究。

为解决这些难题，波士顿儿童医院April M. Craft团队在《Stem Cell Reports》上发表了最新研究成果。研究人员巧妙构建了双报告基因小鼠胚胎干细胞（mESC）系，首次实现了对关节发育早期标志物Gdf5和关节润滑蛋白Prg4的表达动态进行可视化追踪与定量分析，在体外和离体水平系统揭示了TGF-β、Wnt和MAPK信号通路在关节谱系定向分化中的关键作用和调控机制。

研究采用的主要技术方法包括：利用CRISPR-Cas9技术构建Gdf5-tdRFP/Prg4-eGFP双报告基因mESC系；通过定向分化技术将mESC诱导为软骨源性中胚层并进行微团培养；采用流式细胞术定量分析报告基因表达；通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析细胞类型和转录组特征；利用转基因小鼠（Gdf5-R4-LacZ）进行离体肢芽微团培养验证通路调控作用。

TGF-β信号是诱导Gdf5-RFP表达细胞的充分必要条件

研究人员发现，在mESC定向分化为软骨源性中胚层后的微团培养中，TGF-β3处理可显著诱导Gdf5-RFP表达，第10天时超过20%的细胞表达Gdf5-RFP，而未经处理的对照组仅3%-5%。通过延迟添加TGF-β3实验证明，TGF-β信号在微团培养早期（第2-6天）是诱导Gdf5表达所必需的。在TGF-β超家族成员中，仅TGF-β3能有效诱导Gdf5-RFP，而BMP4、Gdf5等均无此作用，表明TGF-β信号在关节祖细胞诱导中具有特异性。

Wnt抑制在TGF-β存在下显著增加Gdf5-RFP阳性细胞比例

研究表明，在TGF-β3存在下，Wnt通路激动剂CHIR99021处理导致Gdf5-RFP阳性细胞显著减少，而拮抗剂IWP2处理则使Gdf5-RFP阳性细胞比例增加约2倍，且呈剂量依赖性。早期（第2-6天）Wnt抑制足以促进Gdf5表达，持续抑制效果更佳。组织学分析显示，TGF-β3+IWP2处理的微团中硫酸化糖胺聚糖（sGAG）丰富，Gdf5-RFP阳性细胞均匀分布于软骨区域，表明Wnt抑制在促进关节谱系分化的同时增强了软骨形成能力。

MAPK抑制在体外培养中诱导早期Gdf5-RFP表达

MEK抑制剂PD0325901（PD）处理可剂量依赖性地诱导Gdf5-RFP早期（第6天）表达，最高达55%细胞阳性，而bFGF处理则显著增加Prg4-GFP阳性细胞比例（最高48%）。单细胞转录组分析显示，PD处理组富含软骨源性细胞，而bFGF处理组则富含连接组织细胞，其中肌腱/韧带标志基因Tnmd和Scx表达上调，表明MAPK信号调控关节谱系中软骨与肌腱/韧带细胞命运抉择。

单细胞转录组分析揭示体外诱导细胞与体内关节组织高度相似

整合分析显示，mESC来源细胞与小鼠胚胎肢芽细胞在软骨形成、连接组织等细胞簇高度重叠。Gdf5表达细胞主要富集于软骨祖细胞和软骨细胞簇，而Prg4表达细胞则分布于多种关节组织谱系，特别是表达Tnmd和Scx的连接组织2簇。通路调控特异性改变细胞簇内基因表达模式，如TGF-β+IWP2处理增强Col2a1、Acan等软骨基质基因表达，而TGF-β+bFGF处理则上调Dusp6、Etv1等MAPK靶基因。

TGF-β、Wnt和MAPK调控在离体胚胎肢芽培养中得到验证

在Gdf5-R4-LacZ转基因小鼠肢芽离体培养中，Wnt激动剂CHIR或MAPK激动剂bFGF显著减少Gdf5-R4-LacZ阳性细胞，而抑制剂IWP2或PD则显著增加其比例，与体外实验结果一致。内源性TGF-β信号在肢芽细胞中已处于活化状态，可能解释外源TGF-β在离体实验中未显著诱导Gdf5表达的现象。

本研究通过创新性双报告基因系统，明确了TGF-β信号在关节祖细胞诱导中的核心地位，揭示了Wnt/MAPK信号时空特异性调控关节谱系分化的新机制。研究发现不仅深化了对关节发育分子机制的理解，更重要的是为基于多能干细胞（PSC）的关节组织工程和关节疾病治疗提供了新的理论依据和技术平台。该研究建立的体外模型成功模拟了体内关节发育的关键事件，证实轴向和附肢骨骼关节细胞定向存在共享机制，为研究关节发育进化保守性提供了新视角。

研究还讨论了Gdf5表达表观遗传调控的解剖复杂性，指出Gdf5-R4增强子在关节特异性表达中的关键作用，这与人类骨关节炎风险相关。尽管本研究存在报告基因与内源基因表达不完全一致等局限，但其建立的研究平台和发现的核心机制为后续关节发育研究和再生医学应用奠定了重要基础。随着对关节祖细胞定向分化机制的深入解析，未来有望开发出针对关节损伤和退行性疾病的创新性治疗策略。