细胞外囊泡递送let-7b/7c促进新生小鼠睾丸过渡态精原细胞增殖的新机制

《Stem Cell Reports》：Extracellular-vesicle-mediated transfer of let-7b/7c promotes the proliferation of transition-state spermatogonia in neonatal mouse testis

本研究揭示了新生儿睾丸来源的细胞外囊泡(EV)通过传递let-7b/7c microRNA，促进精原干细胞(SSC)向过渡放大状态转变并增强其增殖能力的新机制。研究人员通过蛋白质组学和小RNA转录组学分析，发现来自未分化精原细胞和支持细胞的EV携带特定miRNA cargo，调控精子发生过程中的细胞命运决定，为男性生殖障碍治疗提供了新靶点。

　　

在男性生殖生物学领域，精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells, SSCs)的自我更新和分化平衡是维持终生精子产生的关键。这些原始生殖细胞栖息在复杂的睾丸微环境中，周围的支持细胞(Sertoli cells)、管周肌样细胞等 somatic 细胞通过分泌因子构成特殊的"niche"(干细胞巢)，精确调控着SSCs的命运决定。然而，在这种错综复杂的细胞间对话中，细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)作为新兴的信息传递载体，其在精子发生调控中的作用机制仍知之甚少。

以往研究表明，睾丸中存在多种EVs亚群，例如精原细胞分泌的Thy1⁺ EVs可抑制SSCs增殖，而支持细胞来源的EVs则通过miR-486-5p等分子保护SSCs免受氧化应激。但这些研究多聚焦于成年动物，对于精子发生第一波关键期——新生儿阶段的睾丸EVs功能及其 cargo 分子仍缺乏系统解析。这正是香港中文大学郑婷婷团队在《Stem Cell Reports》上发表的最新研究着力解决的问题。

研究人员选择出生后第7天(PND7)的小鼠睾丸作为研究对象，这一时间点的特殊之处在于睾丸内精原细胞亚群已基本建立，且精原细胞是此时的主要生殖细胞类型。通过优化建立的EVs分离方案，团队成功获取了典型杯状形态、粒径约150纳米的睾丸EVs群体，这些囊泡表达CD9、CD81、CD63等经典标志物，而不含calnexin、golgin 97等细胞器蛋白，符合小细胞外囊泡的特征。

当将这些PND7睾丸EVs与原发性精原细胞共培养时，出现了令人振奋的现象：EVs处理显著增加了精原细胞团的数量和大小，BrdU掺入实验证实DNA复制活跃度提升，且细胞凋亡未见增加。更深入的表型分析显示，EVs处理降低了Id4、Gfra1、Zbtb16等干性标志物表达，同时上调了Ngn3、Rarg、Rara等过渡态标志物，但细胞仍保留对视黄酸(Retinoic Acid, RA)诱导Stra8表达的正常响应能力。这些证据表明，睾丸EVs并非简单推动精原细胞向终末分化，而是将其引导至一种可塑性更强的"过渡放大状态"。

为解析细胞组成变化，团队进行了单细胞RNA测序分析。结果显示EVs处理使干细胞集群(Cluster 1,2,5)比例从>40%骤降至<5%，而祖细胞集群(Cluster 3,4,6,7)则呈现1.4-2倍的扩增。伪时间轨迹分析进一步印证了EVs驱动着SSCs向祖细胞状态的转变，并伴随PI3K/Akt、MAPK等干性相关通路的下调，以及细胞黏附、ECM-受体相互作用等分化相关通路的激活。

通过蛋白质组学和小RNA测序，研究人员系统绘制了PND7睾丸EVs的分子图谱。在2,131个检测到的小RNA中，miRNA占比6.06%，其中let-7b、let-7c、miR-125b等干细胞相关miRNA显著富集。蛋白组分析则鉴定出1,583种蛋白质，功能富集显示这些分子主要参与细胞黏附、迁移和增殖等生物学过程。

那么，这些功能性的EVs究竟来自睾丸中的哪些细胞类型？研究团队分别提取了未分化精原细胞系C18-4、分化精原细胞系GC1-spg、支持细胞系TM4和精母细胞系GC2-spd的EVs进行功能比较。有趣的是，只有C18-4和TM4来源的EVs能重现睾丸EVs的表型效应，包括抑制干性基因表达、促进细胞增殖等，且这两种EVs中let-7b/7c含量显著高于组织总RNA。当使用CRISPR/Cas9技术敲低供体细胞中let-7b/7c后，其EVs对精原细胞的调控作用明显减弱，证实了这两种miRNA作为关键cargo分子的功能重要性。

关键技术方法

本研究采用超速离心法从PND7小鼠睾丸组织及精原细胞/支持细胞系中分离EVs，通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析和Western blot进行表征。利用原发性精原细胞培养模型评估EVs功能效应，结合BrdU掺入实验、流式细胞术、单细胞RNA测序等技术分析细胞增殖、分化和转录组变化。采用质谱蛋白质组学和小RNA测序解析EVs cargo组成，并通过CRISPR/Cas9基因编辑验证特定miRNA功能。

研究结果

睾丸EVs促进精原细胞增殖

PKH67标记实验显示睾丸EVs可被80%精原细胞在24小时内有效摄取。EVs处理使精原细胞团数量增加1.58倍，总细胞数提升1.93倍，BrdU阳性细胞比例显著升高，表明EVs通过促进DNA合成驱动增殖，而非抑制凋亡。

EVs引导精原细胞向过渡放大状态转变

实时PCR显示睾丸EVs显著抑制Id4、Gfra1等干性标志物，但上调Ngn3、Rarg、Rara等过渡态相关基因。单细胞测序进一步证实EVs处理使干细胞比例从>40%降至<5%，祖细胞群体显著扩增，伪时间分析显示细胞沿分化轨迹推进。

精原细胞和支持细胞来源的EVs模拟睾丸EVs功能

C18-4和TM4来源的EVs能重现睾丸EVs的表型效应，包括抑制干性标志物表达和促进增殖，而GC1-spg和GC2-spd来源的EVs无此功能，表明EVs的调控作用具有细胞来源特异性。

let-7b/7c作为关键功能cargo

睾丸EVs中let-7b、let-7c等miRNA显著富集，且能被有效传递至受体精原细胞。CRISPR/Cas9敲低供体细胞中let-7b/7c后，其EVs的调控功能明显减弱，证实这两种miRNA在介导EVs效应中起核心作用。

研究结论与意义

该研究首次系统揭示了新生儿睾丸EVs通过传递let-7b/7c miRNA调控精原细胞命运决定的新机制。这种囊泡介导的细胞间通信不仅存在于支持细胞与精原细胞之间，也存在于精原细胞亚群内部，共同构成了睾丸微环境中的精细调控网络。研究为理解精子发生提供了新视角，同时为男性不育症的治疗提供了潜在靶点——睾丸EVs或可作为基因工程载体，用于靶向调控精原细胞的增殖与分化。此外，研究建立的EVs分离表征体系为组织特异性囊泡研究提供了技术参考。值得注意的是，由于睾丸EVs的来源异质性，未来需要进一步解析不同细胞来源EVs的独特功能，以及let-7家族其他成员的可能贡献。