综述：精准基因编辑：CRISPR-Cas在现代遗传学中的力量

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Precision gene editing: The power of CRISPR-Cas in modern genetics

本综述系统梳理了基因编辑技术的发展历程，重点聚焦CRISPR-Cas系统的机制、优势与局限。文章详细介绍了碱基编辑（Base Editing）、引物编辑（Prime Editing）及RNA编辑等新一代精准编辑工具，并深入探讨了病毒与非病毒载体等递送策略。最后，展望了DNA聚合酶编辑器、CRISPR相关转座子（CAST）及人工智能（AI）辅助设计等前沿趋势，为遗传病治疗、癌症研究及生物技术开发提供了全面指导。

　　

基因编辑技术通过对基因组DNA进行精准修饰，已经彻底改变了分子生物学领域。它能够实现特定DNA序列的添加、移除或修改，应用范围涵盖基因敲除、治疗性基因校正以及靶向遗传性状的设计。这些技术的核心依赖于两种主要的DNA修复机制：同源定向修复（HDR），可实现精确的基因组改变；以及非同源末端连接（NHEJ），这通常会导致缺失或移码错误等突变。在众多基因编辑平台中，CRISPR-Cas系统因其简单、低成本和高效性而成为应用最广泛的工具。

基因编辑技术的历史背景

基因编辑技术的发展经历了几个关键阶段。兆核酸酶（Meganucleases）是最早的可编程核酸酶之一，能识别14-40个碱基对（bp）的大片段DNA，具有高特异性，但其靶向特异性重编程困难。锌指核酸酶（ZFN）由锌指DNA结合域和FokI核酸酶域组成，每个锌指 motif 识别一个三碱基序列。转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）则来源于植物病原体，其DNA结合域中的重复可变双残基（RVD）可识别单个核苷酸（如NI识别A，HD识别C）。与ZFN类似，TALEN也需要二聚化才能切割DNA。尽管ZFN和TALEN各有优势，但它们都需要为每个基因组靶点定制DNA结合蛋白，且其模块化结合域可能存在上下文依赖的脱靶活性，大尺寸的TALEN蛋白也难以包装进容量有限的病毒载体。

CRISPR-Cas系统

CRISPR-Cas系统是当前最主流的基因组编辑平台。它被广泛使用得益于其设计简单、成本低、效率高、可重复性好且实验周期短。CRISPR系统可分为两大类：利用多蛋白效应器复合物的I类系统（包括I型、III型和IV型）和利用单蛋白效应器的II类系统（包括II型、V型和VI型）。其中，CRISPR-Cas9（II类，II型）是研究最深入、应用最广泛的工具。

CRISPR-Cas9系统包含两个核心组件：引导RNA（gRNA）和CRISPR相关蛋白9（Cas9）。gRNA由CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）组成。crRNA长约18-20个核苷酸，与靶DNA序列杂交；tracrRNA则作为Cas9结合的支架。Cas9蛋白包含识别叶（REC lobe）和核酸酶叶（NUC lobe）。核酸酶叶含有RuvC和HNH两个结构域，分别切割DNA的双链，以及一个负责识别原型间隔序列邻近基序（PAM）的PAM相互作用域。

其作用机制分三步：靶序列识别、诱导DNA双链断裂（DSB）和DNA修复。设计好的单链引导RNA（sgRNA）通过其间隔序列与靶DNA碱基配对，将Cas9导向特定位点，同时Cas9与靶位点下游的PAM序列结合。对于常用的化脓链球菌Cas9（SpCas9），PAM序列通常是5‘-NGG-3’。一旦识别PAM并形成RNA-DNA杂交体，Cas9即通过HNH域切割互补链，通过RuvC域切割非互补链，从而产生DSB。随后，细胞通过HDR或NHEJ途径修复断裂。

然而，CRISPR-Cas9平台存在明显的局限性，主要是脱靶效应，即CRISPR-Cas9复合物在非预期的基因组位点结合并切割。此外，PAM序列的限制也约束了CRISPR可靶向的基因组位置。为此，科学家开发了如SpCas9-NG（可识别NG PAM）和xCas9等变体，以扩展靶向范围。

当前CRISPR编辑技术

除了传统的CRISPR-Cas9，一系列新技术已经涌现。

碱基编辑（Base Editing）由David Liu实验室于2016年首次报道。该技术将RuvC失活的Cas9切口酶（nCas9(D10A)）与核苷脱氨酶融合，无需产生DSB即可实现直接的碱基转换。主要包括胞嘧啶碱基编辑器（CBE），催化C·G到T·A的转换；以及腺嘌呤碱基编辑器（ABE），催化A·T到G·C的转换。其优势在于极高的精确度，最大限度地降低了indel和脱靶效应风险。

引物编辑（Prime Editing）则整合了nCas9(H840A)变体、逆转录酶（RT）和特殊设计的引物编辑指导RNA（pegRNA）。pegRNA包含sgRNA、引物结合位点（PBS）和逆转录模板（RTT）。该系统能在不引起DSB且无需供体DNA模板的情况下，实现碱基替换、小片段插入或缺失，甚至大片段基因删除，精度更高，副产物更少。

RNA编辑是一种转录后方法，利用Cas13或Cas7-11等系统靶向修改RNA序列，从而调控蛋白质表达，而不会对基因组造成永久性改变。通过融合ADAR2（将腺苷A转变为肌苷I）或APOBEC（将胞嘧啶C转变为尿苷U）等脱氨酶，可以实现对转录本的重新编程。

转录调控器利用催化失活的Cas9（dCas9）与转录抑制域（如KRAB）或激活域（如VP64）融合，靶向基因启动子区域，实现基因表达的抑制（CRISPRi）或激活（CRISPRa），且不改变DNA序列。更先进的系统如协同激活介质（SAM）能实现更强的基因激活。

精准基因递送技术

CRISPR递送系统对于将CRISPR-Cas组分高效运输到靶细胞至关重要。递送形式可以是编码Cas蛋白和sgRNA的DNA、Cas mRNA和sgRNA的RNA，或Cas蛋白与sgRNA预组装的核糖核蛋白（RNP）复合物。递送方式主要分为病毒载体、非病毒载体和物理方法。

病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒（AAV）、逆转录病毒和慢病毒。AAV因其高稳定性、复制缺陷和低免疫原性而被广泛应用，但其载体容量有限。非病毒载体如病毒样颗粒（VLP）、脂质纳米粒（LNP）、聚合物纳米粒、DNA纳米球和无机纳米粒，具有更高的载荷容量和更好的安全性，但系统性地靶向肝外组织仍是一大挑战。物理递送方法如电穿孔、膜变形技术（如微流体细胞挤压）和声孔效应，通过瞬时破坏细胞膜来实现递送，但可能需要对深层器官进行手术干预。

CRISPR技术的治疗应用

CRISPR基因编辑技术为 previously 被认为无法治疗的疾病提供了 promising 的治疗途径。其治疗策略主要分为体外（ex vivo）和体内（in vivo）两种。

体外基因编辑涉及在患者体外修改自体细胞，然后回输。这个过程包括细胞分离、基因编辑和回输。其优势在于患者不直接暴露于基因编辑组分，降低了系统暴露风险。首个获批的CRISPR疗法Casgevy（exa-cel）就是采用此策略，通过编辑造血干细胞来治疗镰状细胞病（SCD）和输血依赖性β-地中海贫血（TDT）。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法也是体外编辑的典型应用。此外，将诱导多能干细胞（iPSC）技术与CRISPR结合，为个性化细胞治疗提供了潜力。

体内基因编辑则直接对患者体内的遗传物质进行修改。虽然技术更复杂，但它避免了细胞移植的限制，扩大了治疗应用的疾病范围。其成功高度依赖于高效、特异的递送系统。

基因编辑的新兴趋势

前沿技术正在不断拓展基因编辑的能力边界。

DNA聚合酶编辑器将nCas9(H840A)与DNA聚合酶和通过HUH内切酶连接的ssDNA模板结合，能够避免gRNA的自抑制碱基配对，实现超过100个核苷酸的长序列插入。点击编辑器（Click Editor）利用点击化学优化了该过程。

CRISPR相关转座子（CAST）将crRNA引导的DNA转座功能与CRISPR系统结合，能在不产生DSB的情况下实现位点特异性的大片段DNA整合。类型I-F3和V-K CAST是研究较多的系统。

大基因的位点特异性整合技术，如引物编辑辅助的位点特异性整合酶基因编辑（PASSIGE）和通过位点特异性靶向元件的可编程添加（PASTE），将引物编辑与位点特异性重组酶（如Bxb1）结合，实现了 kilobase 级别DNA序列的高效插入。

逆转录元件编辑（如靶向引发逆转录TPRT）模仿逆转录转座子（如LINE-1）的机制，利用nCas9(H840A)和逆转录酶，通过RNA模板将新序列整合到基因组中。

表观遗传编辑通过将dCas9与DNA甲基转移酶或组蛋白修饰酶融合，在不改变DNA序列的情况下实现基因表达的稳定、可遗传的调控（CRISPRoff/CRISPRon）。

CRISPR启用的自主转座元件（CREATE）将CRISPR-Cas9与RNA介导的转座元件（如LINE-1）整合，实现了基于RNA的大片段基因靶向整合。

人工智能（AI）在CRISPR工作流程中发挥着越来越重要的作用，包括设计CRISPR组件、预测脱靶事件、优化gRNA以及模拟编辑结果。深度学习算法有助于开发高特异性gRNA，并指导最佳递送策略的选择。

结论与未来展望

持续的研究努力集中在提高CRISPR系统的效率和多功能性，以及改进基因递送平台。特别是在优化体内递送方法方面取得了实质性进展，以在最大化编辑效率的同时最小化脱靶效应。这些进步显著扩展了CRISPR的治疗潜力。CRISPR-based疗法的未来成功将取决于编辑精度和递送技术的进一步改进。持续的技术挑战，如提高递送效率、最小化免疫反应和减少意外的遗传修饰，必须通过持续的研究来解决。