Prime编辑技术精准修复RBM20-P633L突变：扩张型心肌病基因治疗新突破

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Prime editing corrects the dilated cardiomyopathy causing RBM20-P633L-mutation in human cardiomyocytes

本研究针对扩张型心肌病（DCM）的基因治疗难题，开发了基于Prime编辑（PE）技术的精准修复策略。研究人员通过构建靶点筛选平台（TA-HEK），优化pegRNA设计，成功在人类心肌细胞（hi-CMs）中高效纠正RBM20-P633L突变（编辑效率达34.8%），并恢复RBM20核定位及CAMK2D基因的正常剪接。该研究首次在终末分化细胞中实现DCM致病突变的表型挽救，为遗传性心脏病治疗提供了新范式。

　　

心脏作为终末分化器官，一旦遭受基因突变引发的损伤，几乎无法自我修复。扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy, DCM）正是一类由基因突变导致的心肌病变，全球约1/220人群受其影响，其中25%-35%病例与遗传因素相关。致病基因LMNA和RBM20的突变分别占家族性DCM的5.9%和3%，尤其RBM20基因的P633L突变会引发蛋白质错误定位与剪接紊乱，最终导致心力衰竭。传统基因编辑技术如CRISPR-Cas9依赖DNA双链断裂和细胞增殖修复机制，难以在非分裂的心肌细胞中安全应用。而新兴的Prime编辑（Prime Editing, PE）技术能够在不引起双链断裂的前提下实现精准基因修复，为DCM治疗带来曙光。

本研究由德国Max Delbrück分子医学中心的Alexandra Roman等学者主导，旨在验证PE技术在人类心肌细胞中纠正DCM致病突变的可行性。研究团队首先构建包含LMNA^K117fs、RBM20^P633L和RBM20^R634Q突变的靶点阵列（Target Array, TA）HEK293T细胞系，通过pegRNA筛选平台鉴定高效编辑工具。随后利用AAV载体递送优化后的epegRNA，并结合体外转录的PEmax及MLH1dn mRNA，在hiPSC分化的心肌细胞（hi-CM）中开展功能验证。

关键技术方法包括：

1. 1.
   利用TA-HEK细胞系进行pegRNA高通量筛选；
2. 2.
   采用PE4系统（PEmax+MLH1dn）抑制错配修复，提升编辑效率；
3. 3.
   使用AAV-DJ载体递送epegRNA，并通过电转递送mRNA至hi-CM；
4. 4.
   通过免疫荧光染色与RT-PCR分析RBM20定位及CAMK2D剪接修复效果。

结果1：PE系统在报告细胞中的验证

通过Venus荧光报告系统验证PE2与PEmax编辑器的效率，发现PEmax在HEK293T细胞中对终止密码子的修复效率达29.4%，显著优于PE2（19.4%），因此后续实验均采用PEmax系统。

结果2：TA-HEK平台筛选高效pegRNA

在TA-HEK模型中，LMNA-epegRNA-04对LMNA^K117fs的纠正效率达37.3%，而RBM20-epegRNA-12可同时修复P633L和R634Q突变（效率分别为29.8%和20.5%）。引入PE3b策略（添加切口sgRNA）后，LMNA编辑效率进一步提升至58.4%。

结果3：PE纠正hi-CM中的RBM20^P633L突变

在纯合P633L/P633L hi-CM中，RBM20-epegRNA-12的PE4系统实现34.8%的T-to-C编辑，且脱靶效应可忽略。杂合突变模型中，野生型等位基因比例从49.1%升至65.6%（p<0.001）。然而，对RBM20^R634Q和LMNA^K117fs的编辑效率分别仅为4.6%和1.05%，表明编辑效果具有突变特异性。

结果4：基因纠正恢复RBM20功能

免疫染色显示，PE4处理的hi-CM中RBM20核定位显著恢复（Pearson系数从0.2升至0.55），且CAMK2D外显子15的错误剪接比例下降4.1倍，表明突变表型成功逆转。

讨论与结论

本研究首次在人类终末分化心肌细胞中实现PE介导的DCM突变精准修复与表型挽救。尽管不同突变位点的编辑效率存在差异，但RBM20^P633L的高效纠正证明PE技术适用于遗传性心脏病治疗。未来需优化体内递送策略（如AAV-MYO载体或LNP封装mRNA），并探索PE技术对其他心脏遗传病的应用潜力。该工作为临床转化提供了关键实验依据，标志着心脏基因编辑治疗迈入新阶段。