噬菌体研究新范式：从分枝杆菌噬菌体探索微生物学的整合之路

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：All the world’s a phage

本综述系统阐述了以分枝杆菌噬菌体（Mycobacteriophage）为模型，整合好奇心驱动的基础研究（如噬菌体多样性、基因组进化）、包容性科研教育项目（SEA-PHAGES）与噬菌体疗法（Phage Therapy）的协同发展模式。文章强调了这种“三位一体”的策略如何深化我们对病毒生物学（如 mosaic 基因组结构、原噬菌体防御系统）的理解，并为应对抗生素耐药性（如结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌感染）提供了创新治疗工具（如噬菌体工程化改造 BRED/CRISPY-BRED 技术）和科学教育范式（iREC），是推动21世纪微生物学发展的典范。

　　

从模型系统到生物暗物质

噬菌体是感染细菌宿主的病毒。尽管在一百多年前就被描述，但过去几十年间，人们对其作为生物学研究对象和潜在抗菌剂的兴趣几经起伏。在二十世纪五十年代至七十年代，噬菌体因其相对简单的生命周期、快速生长、可高滴度增殖以及相对较小的基因组，为发现分子生物学、基因结构和生物信息流的基本原理提供了强大的模型系统。其治疗潜力早期曾受到相当大的关注，但在世界大部分地区，二十世纪四十年代抗生素的进展迅速取代了噬菌体疗法，尽管后者在东欧和前苏联得以延续。如今，对噬菌体的兴趣正在复苏，这主要源于两个关键发展。首先是细菌用于防御噬菌体攻击的丰富系统的快速发现，这些系统补充了限制修饰（R-M）和CRISPR-Cas，并提供了革命性的生物技术工具。其次是对噬菌体疗法兴趣的复苏，这是由于对细菌对抗生素耐药性迅速增加的担忧。噬菌体在治疗临床难治性感染中的明显成功应用进一步推动了这一兴趣。

另外两个因素也促进了噬菌体研究的复兴。首先是认识到噬菌体及其基因组的巨大多样性。用于发现分子生物学基本原理的模式大肠杆菌噬菌体是极好的范例，但将我们的理解扩展到更广泛的噬菌体种群，揭示了许多关于病毒生物学的新见解，并明确了噬菌体确实代表了生物圈的暗物质，拥有大量功能未知的基因。考虑到噬菌体总颗粒数预计超过10³¹，与细菌的动态相互作用每秒达10²³次感染，并且这一切可能已经持续了三十亿年，这自然产生了巨大的多样性。界定这种多样性以及揭示未知基因的功能仍然是噬菌体生物学的主要挑战。其次是认识到噬菌体发现和基因组学为科学教育带来的强大系统。其中影响最大的项目可能是SEA-PHAGES项目，已有超过50,000名学生参与，发现了近30,000种新的噬菌体。

阐明噬菌体生物学的基础、科学教育以及包括噬菌体疗法在内的转化方面，提供了一个完全整合的战略，其中每一项使命都强有力地相互促进。选择合适细菌宿主来了解噬菌体多样性和进化、科学教育项目如何有力推动噬菌体生物学进展，以及由此产生的噬菌体库和各种工程工具如何推动噬菌体在分枝杆菌感染治疗中的应用前景，是本文阐述的重点。反过来，临床应用也促进了科学教育项目的作用，并对进一步了解噬菌体及其与细菌宿主的动态相互作用提出了需求。这种组织好奇心驱动科学、科学教育和转化应用使命的结构，是一个可以在许多不同科学领域采用，并且 arguably 应该采用的模型。

这篇文章的标题是已故同事兼合作者Roger Hendrix博士最喜欢的短语，并作为我们1999年合著的一篇论文的部分标题使用。当时这种观点更像是一种预测，因为噬菌体种群的性质刚刚显现。二十五年多过去了，这种生命观已经建立在坚实的基础上，并且重构了杜布赞斯基的观点，即微生物学中没有什么是有意义的，除非从噬菌体-细菌动态相互作用的角度来看。本文描述了在以分枝杆菌为宿主研究噬菌体的背景下，促成这一观点的历史背景和进展。

为什么选择分枝杆菌？

分枝杆菌是放线菌门中的一个属，包含几种著名的人类病原体。这些包括结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，它们分别是人类结核病（TB）和麻风病的病原体，以及机会性非结核分枝杆菌（NTM），包括鸟分枝杆菌复合体和脓肿分枝杆菌菌株。这些菌株对全球人类健康造成重大影响，全球约三分之一人口感染结核分枝杆菌，每年导致约125万人死亡。为期六个月（“短程疗法”）的四种抗生素联合治疗是常见的结核病治疗方案，但完成治疗具有挑战性，尤其是在结核病最常见的第三世界国家，耐药菌株也日益令人担忧。机会性NTM感染比结核病流行程度低，但通常困扰囊性纤维化或免疫紊乱患者。然而，它们通常对抗生素固有地不敏感，同时也获得了耐药性。此外，许多抗生素毒性相当大，许多患者耐受性不佳。这些感染的临床管理对患者和医生来说往往是一场噩梦，需要数月或数年的治疗却无法控制感染。

分枝杆菌宿主噬菌体（分枝杆菌噬菌体）在75年多前首次分离，部分动机在于通过噬菌体分型进行微生物诊断的潜力。分枝杆菌噬菌体介导的普遍性转导在1970年得到证实，但缺乏简便的遗传工具阻碍了分枝杆菌遗传学的发展。此外，结核分枝杆菌和一些NTM菌株众所周知的缓慢生长（倍增时间20至24小时）使它们成为遗传分析的挑战性系统，通常需要3至4周才能从单个细胞生长成细菌菌落。开发合适的非致病性、相对快速生长的分枝杆菌菌株，即耻垢分枝杆菌，极大地推动了该领域的发展，尽管对直接研究细菌毒力机制用处较小。

在二十世纪八十年代和九十年代，对噬菌体基础生物学的研究普遍不受青睐。Bill Jacobs及其同事开创了使用分枝杆菌噬菌体发展分枝杆菌遗传学的先河，鉴于分枝杆菌病原体的临床重要性，研究分枝杆菌噬菌体的基础生物学和基因组学有充分的理由（以及资助机会！）。一些在耻垢分枝杆菌上分离的噬菌体先前已被描述，第一个被测序的是L5噬菌体，它是继典型大肠杆菌噬菌体之后最早完成全基因组测序的噬菌体之一。L5序列提出了关于噬菌体多样性和进化的重要问题，在接下来的几年里，其他先前描述的分枝杆菌噬菌体——包括D29和TM4——的基因组也被测序。结果，我们对噬菌体基因组多样性和相关性的看法扩大了；我们了解到，即使是感染不同细菌、被大段进化时间分隔的噬菌体，也具有相关的基因和特征。确实，整个世界都是一个噬菌体。

教育与发现：PHIRE 和 SEA-PHAGES

很快变得明显的是，如果没有更大的数据体——即更多的噬菌体和更多的噬菌体基因组——我们对噬菌体多样性和基因组进化的看法不会发生实质性改变。为什么不让学生参与噬菌体发现和基因组学，既推动这些研究问题，又为新手学生科学家提供研究机会呢？在初步成功之后，我们利用它开发了由霍华德·休斯医学研究所（HHMI）教授计划支持的“整合研究与教育的噬菌体猎人”（PHIRE）项目。该项目始于2002年，涉及匹兹堡的高中生和本科生分离新的耻垢分枝杆菌噬菌体并对其进行基因组表征。该项目很受欢迎，并有效地极大地扩展了我们对噬菌体世界的看法，同时让年轻学生深入参与科学和科学研究。我们学到了一些关键经验：首先，这项研究对这些学生新手来说是易于理解的；其次，基因组测序是项目的必要组成部分，没有它，你对噬菌体或其进化起源知之甚少；第三，噬菌体的巨大多样性几乎保证了每个学生都会分离到不同的噬菌体；第四，项目所有权——学生研究并关心他们自己分离、命名和表征的噬菌体——是一个强大的激励因素。

PHIRE项目是一个很好的模型，但未发现的噬菌体世界是巨大的，对高影响力教育创新的需求至关重要。2008年，核心概念被用于开发HHMI支持的“科学教育联盟噬菌体猎人推进基因组学和进化科学”（SEA-PHAGES）项目，利用了推进科学知识与科学教育不可分割的整合优势：一举两得（或者如果你喜欢，可以说是买一赠一）。你可以将其视为一个科学项目，其中教育进展是免费的；或者视为一个教育项目，其中科学进展是免费的。主要的项目创新是集中化项目基础设施，包括科学方向、协议、数据库、教师培训、研讨会等，使得几乎任何机构、任何教师和任何学生都可以参与项目；整体结构被称为包容性研究教育社区（iREC）。建立和维护像SEA-PHAGES这样的iREC成本相当高，但这种结构使其具有高度可扩展性，这是科学教育项目普遍面临的一个特别具有挑战性的方面。因此，每名学生的成本变得非常可承受，并且对科学和教育可量化的益处具有很高的成本效益。

截至2025年，约有170所机构参与SEA-PHAGES，已持续运行18年。超过50,000名学生——主要是大学一年级本科生——参与了该项目，分离出超过28,000种单独的噬菌体，其中超过5,500种已完成全基因组测序；SEA-PHAGES项目已产生超过400篇出版物。细菌宿主的类型已扩展到包括放线菌门内的其他细菌，并且有意限制使用密切相关的细菌宿主，以便深入了解噬菌体基因组的亲缘关系。这反映了项目在病毒多样性和进化方面的主要科学使命。当然，此类项目可以有不同的科学使命，从而促使选择不同的细菌宿主。

PHIRE和SEA-PHAGES项目的学生为他们分离的噬菌体选择名称（在适当的监督下）。这有助于增强项目所有权的意识，学生们通常经过长时间深思熟虑才选择名字（“因为这很重要！”）。虽然这是一个非系统化的命名系统，但它反映了噬菌体具有个体特征的观点，并且基因组学显示几乎没有明显的分类边界证据。这确实导致了一些有趣的名字，其中像Corndog、Patience、CocoaPuff、FatCactus和Phamished等是一些最受欢迎的。

iREC结构是一个强大的结构。它可以用于解决各种不同的科学问题，尽管噬菌体多样性和进化似乎特别合适。其他几个项目，包括Tiny Earth和基因组学教育伙伴关系，具有类似的iREC结构，但显然有机会积极开发新的iREC项目。然而，一个挑战是需要最初投入资金来建立该结构。联邦资助机构可以在这方面发挥主要作用，遵循一个关键原则：一个结构良好的项目可以有效地提供科学进展，同时以无额外成本实现内在的教育进展。联邦机构与基金会或公司之间的公私伙伴关系是特别有吸引力的机制。

噬菌体多样性与进化：从2600个基因组中学到了什么？

分枝杆菌噬菌体的病毒粒子形态显示，它们都是dsDNA有尾噬菌体，尚未分离到ssDNA或RNA噬菌体。此外，只鉴定出三种主要dsDNA有尾噬菌体形态型中的两种。C簇和AA簇中的噬菌体是具有收缩尾部的肌尾噬菌体病毒粒子，但所有其他都是长非收缩尾部的长尾噬菌体。大多数群具有等距（“足球状”）衣壳，但有些具有长形（拉长）头部（例如，O簇、I簇和单例MooMoo）。然而，尚未分离到具有短粗尾部的分枝杆菌短尾噬菌体，尽管这些噬菌体对于其他细菌很常见。这可能是由于分枝杆菌复杂的细胞壁对此类噬菌体构成了物理限制。如果仅通过分离和病毒粒子形态分析来研究噬菌体，那么它们的遗传多样性将仍然未被发现，这就是为什么基因组学是教育项目关键组成部分的原因。

在PHIRE和SEA-PHAGES项目中分离的28,000种噬菌体中，超过14,000种单独的噬菌体感染耻垢分枝杆菌，其中超过2,600种已完成全基因组测序。这些噬菌体都是在完全相同的菌株，耻垢分枝杆菌mc²155上分离的，为任何此类噬菌体集合提供了对病毒多样性的最高分辨率洞察。基因组比较显示，使用成对分析中簇内噬菌体共享超过35%基因的任意截止值，这些噬菌体中的大多数可以被分组到相关噬菌体的簇中（A簇、B簇、C簇等）。其中一些簇可以划分为亚簇，尽管划分的参数在不同簇中有所不同。一些噬菌体（目前有三个）没有近亲，是“单例”。从该噬菌体集合中可以明显看出关于病毒多样性和进化的几个关键发现。

首先是噬菌体代表的异质性。例如，A簇和B簇中分别有超过800和460种单独的噬菌体，但有15个簇只有半打或更少的噬菌体。其次，簇和亚簇内部存在显著的多样性。例如，在F1亚簇内，一些成对比较显示噬菌体共享基因少于50%。第三，不同簇和亚簇之间的“边界”最多是模糊的，因此不同的聚类参数会给出不同的分组。很可能存在一个潜在的多样性连续体，尽管单个噬菌体的代表不均匀，并且网络分析揭示了某些簇之间的联系。第四，噬菌体具有通过噬菌体间普遍的水平基因交换（由非法重组事件介导）产生的镶嵌结构。最后，约70%的噬菌体基因功能未知，阐明成千上万分枝杆菌噬菌体基因的作用既是一个主要优先事项，也是一个重大挑战。

大多数分枝杆菌簇包含温和噬菌体，其他是裂解性的；36个簇中的22个以及所有三个单例是温和的，只有14个簇是裂解性的。然而，在基因组上归入“温和”簇的噬菌体实际上是裂解性的情况相对常见。一个很好的例子是噬菌体D29，它是裂解性的，感染耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌，但在基因组上归入A簇，而大多数A簇噬菌体是温和的。这种现象可以通过清晰噬菌斑变体的出现来解释，这些变体可能更容易观察和挑选纯化，并且这些噬菌体通常具有明显可辨的阻遏蛋白基因缺失。基因组比较表明，122个A2簇噬菌体中约有10%是清晰噬菌斑变体。

大多数温和分枝杆菌噬菌体编码一个整合系统，包括一个attP附着位点和一个整合酶基因，包括酪氨酸整合酶和丝氨酸整合酶，并且已经鉴定出许多不同的系统。大多数酪氨酸整合酶系统使用与宿主tRNA基因重叠的attB位点，这在原噬菌体形成后重建，而丝氨酸整合系统使用位于编码区内的attB位点，导致溶原细胞出现生理表现。检查非模式噬菌体的一个优势是发现遗传新颖性，尤其是在噬菌体生命周期调控方面。一个值得注意的例子是整合依赖性免疫系统，其中attP位点奇怪地位于阻遏蛋白基因本身内部。阻遏蛋白的病毒版本编码一种无活性的蛋白质，因为存在促进降解的C末端信号。整合导致降解标签的丢失，并表达稳定形式的阻遏蛋白，赋予超感染免疫。在第二个例子中，一些噬菌体使用tRNA依赖性溶原系统，其中需要噬菌体编码的tRNA来补偿整合后attB处宿主tRNA的失活。有趣的是，缺乏自身tRNA的突变噬菌体具有清晰噬菌斑表型，因为由于宿主tRNA功能丧失，稳定的溶原菌是不可存活的。

原噬菌体与病毒防御系统

由于耻垢分枝杆菌的温和噬菌体很常见，许多分枝杆菌菌株自然是溶原的，并携带自身的原噬菌体。已测序的耻垢分枝杆菌菌株相对较少，并且已知mc²155菌株是无原噬菌体的。有趣的是，结核分枝杆菌菌株也是无原噬菌体的，这不仅适用于实验室菌株，也适用于数千个已测序的临床分离株。相比之下，许多脓肿分枝杆菌菌株已被测序，它们富含原噬菌体。至少75%的脓肿分枝杆菌菌株含有至少一个原噬菌体，有些含有六个或更多；平均数量约为1.5。通常，这些原噬菌体与耻垢分枝杆菌噬菌体亲缘关系不近，但同样多样化。将分枝杆菌原噬菌体和耻垢分枝杆菌噬菌体整合到一个共同的架构中，揭示了超过60个簇和18个单例。对这些分枝杆菌原噬菌体的生物学知之甚少，但它们值得进一步研究，因为它们可能在决定这些临床分离株的噬菌体感染谱方面发挥作用，如下文进一步讨论。

令人惊讶的是，温和噬菌体和常驻原噬菌体是防御裂解性噬菌体攻击的主要来源，极大地扩展了已知的细菌泛免疫噬菌体防御系统，但具有易于在细菌之间交换的优势；因此它们是细菌-噬菌体军备竞赛的核心。这些防御系统是异型防御，防御无关的噬菌体，并区别于阻遏蛋白介导的免疫，后者保护免受相同或非常相近噬菌体的裂解感染（同型防御）。此类系统是溶原性表达的，通常位于阻遏蛋白和整合酶基因附近。噬菌体Sbash提供了一个很好的例子，它特异性地防御噬菌体Crossroads，并编码第二个不明确的系统，通常防御Q簇噬菌体。然而，在许多其他例子中，许多类似位置的基因也被推测参与防御，等待进一步研究。

噬菌体作为工具箱

分枝杆菌噬菌体不仅揭示了病毒多样性和进化的见解，还提供了必要的分子工具。首先，是Bill Jacobs Jr.博士及其同事开发的穿梭噬菌粒，其中构建了嵌合噬菌体，用于有效递送转座子、报告基因和等位基因交换底物。其次是整合 proficient 质粒载体，能够构建用于互补和其他遗传分析的单拷贝重组菌株。第三是重组工程系统，使用分枝杆菌噬菌体编码的重组系统构建基因敲除和其他类型的突变体。其中一些已被组合使用，例如ORBIT系统。第四是使用几种类型的噬菌体启动子在分枝杆菌中表达基因，包括噬菌体L5的高活性P_left启动子，以及一套来自噬菌体BPs的、具有明确启动子活性水平的校准启动子。

还有其他一些噬菌体衍生的工具不太常用，但可能仍会找到广泛用途。一种是在质粒样复制温和原噬菌体中鉴定出的一系列复制起点，它们体积小、染色体外且拷贝数相对较低。A簇中的一部分温和噬菌体不编码attP-整合酶系统，相反，它们的原噬菌体进行染色体外复制。至少描述了八种不同的类型，并使用蛋白质介导或RNA介导的复制起点。其次是使用温和噬菌体阻遏蛋白作为可选择标记。所有温和噬菌体都编码一种在原噬菌体中表达的阻遏蛋白，并关闭裂解生长，从而赋予对同一噬菌体超感染的免疫性。携带噬菌体阻遏蛋白的质粒可以通过电穿孔引入分枝杆菌菌株，并在存在噬菌体裂解衍生物的情况下选择转化子。这已在耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌中得到证明，使用噬菌体Adephagia编码的阻遏蛋白和该噬菌体的阻遏蛋白突变体。感染结核分枝杆菌的基因组差异显著的噬菌体相对较少，因此完全兼容的系统库可能有限，尽管对于耻垢分枝杆菌来说数量众多。如果监管问题对构建强毒结核分枝杆菌的抗生素耐药衍生物施加限制，阻遏蛋白选择系统可能会找到广泛的用途。还值得注意的是，像Bxb1整合系统这样的工具已经在分枝杆菌遗传学之外找到了广泛的生物技术用途。

裂解生长噬菌体的工程化提出了挑战，因为诸如抗生素抗性基因之类的遗传可选择标记不太有用。为了避免使用此类标记，高效的重组系统可以产生足够高频的重组子，从而不需要选择，并且可以通过筛选来鉴定所需的突变体。噬菌体电穿孔DNA重组（BRED）通过部署分枝杆菌重组工程系统，以及简单共电转噬菌体基因组DNA和合成DNA底物来提供这些能力。通过电穿孔回收的原代噬菌斑可以通过PCR进行筛选，并且含有野生型和突变型等位基因的混合噬菌斑可以纯化并通过PCR重新筛选。BRED的局限性在于较大噬菌体基因组的转染效率差，并且点突变和插入通常需要更广泛的筛选。应用CRISPR-Cas针对亲本噬菌体进行选择（CRISPY-BRED）增强了突变噬菌体的选择性回收，并且也可以与将DNA底物电转入噬菌体感染细胞一起使用[带有感染性颗粒的噬菌体重组工程（BRIP）]。

噬菌体作为药物

分枝杆菌噬菌体的首次治疗用途是治疗一名患有囊性纤维化的年轻人，该患者在双肺移植后出现了播散性脓肿分枝杆菌感染。确定治疗性噬菌体的过程需要付出巨大的努力，但获得了良好的结果和患者临床状况的极大改善。由于从环境样本中发现噬菌体未能提供许多有用的新噬菌体，因此选择了代表基因组多样性的一部分耻垢分枝杆菌噬菌体用于筛选。三种噬菌体——Muddy、BPs和ZoeJ——被确定为最佳治疗候选者，但BPs和ZoeJ都是温和的，需要进行工程化改造以成为强制裂解性的。此外，BPs不能有效感染该临床分离株（脓肿分枝杆菌GD01），尽管其噬菌体尾钉蛋白中带有氨基酸替换的宿主范围突变体可以。这三种噬菌体被制备成鸡尾酒形式，以每种噬菌体10⁹空斑形成单位（PFU）的剂量每天两次给药。患者表现出显著改善，尽管感染不太可能被完全清除，但患者能够恢复许多正常活动；噬菌体给药持续了数年。

这个案例提供了几个重要的启示。首先，静脉注射噬菌体是安全的，没有观察到严重的副作用。其次，分枝杆菌感染可能需要像抗生素一样进行长期的噬菌体治疗。第三，分枝杆菌感染的治疗效用前景值得进一步研究。同样引人注目的是，人们对这些类型的噬菌体疗法知之甚少，包括剂量、方案、药代动力学或药效学、噬菌体与抗生素的相互作用，以及因噬菌体耐药性导致治疗失败的可能性。同样值得注意的是，如果没有利用教育项目提供的噬菌体库以及先前分枝杆菌噬菌体生物学研究中获得的见解，确定合适的治疗性噬菌体可能是不可能的。

对额外脓肿分枝杆菌菌株的筛选为总共20个连续病例研究提供了噬菌体，为了解更广泛治疗应用的前景提供了见解。其中，有5个病例无法获得任何数据，其余15个病例中有11个报告了良好的结果；4个病例没有显示临床或微生物学改善的证据。所有患者都是在同情使用的基础上接受治疗的，并且有其他临床问题，所有患者都继续接受标准抗生素治疗以及噬菌体。需要进行良好对照的临床试验来了解治疗潜力以及影响结果的参数，尽管NTM感染患者是招募此类试验特别困难的队列。尽管如此，同情使用案例显示了强大的安全性特征以及许多这些困难病例令人鼓舞的结果，并为进一步探索治疗效用提供了鼓励。

扩大NTM噬菌体疗法的一个特别关键的限制是脓肿分枝杆菌临床分离株的噬菌体感染谱存在巨大差异。这要求对每个分离株进行经验性测试，以确定其对噬菌体的敏感性以及在体外（并希望在体内）被噬菌体有效杀灭的能力。将噬菌体应用扩展到更多临床分离株需要扩大当前治疗上有用的噬菌体库（目前只有6-8种亲本噬菌体及其宿主范围突变体），并阐明细菌和噬菌体中特异性的遗传决定因素。一个具体问题是脓肿分枝杆菌光滑和粗糙菌落形态类型显示的不同谱。光滑菌落类型可被视为“野生型”，存在于环境中，并且可能是许多感染的来源。很少有噬菌体既能有效感染又能有效杀灭光滑菌株，这些菌株占所有临床分离株的40-50%。因此，需要一项重大计划来了解光滑菌株中噬菌体杀灭的局限性。粗糙菌株可被视为“突变体”，在细胞壁糖肽脂的合成或输出方面存在缺陷。目前有限的噬菌体库中至少有一种噬菌体能有效感染约75%的粗糙菌株，这些菌株一直是额外治疗病例的主要对象。

值得注意的是，脓肿分枝杆菌临床分离株中丰富且可变的原噬菌体含量可能有助于其噬菌体感染谱的变化，鉴于上述发现的原噬菌体介导的防御系统。由于结核分枝杆菌分离株遗传多样性有限且无原噬菌体，其噬菌体感染谱的变化也小得多。这提高了可能性，即一个小的明确噬菌体鸡尾酒可能具有广泛的治疗用途，并可能为进行临床试验以确定噬菌体疗法对结核病的潜在效用铺平道路。

展望未来：未来十年的愿景

未来十年有望在噬菌体生物学方面取得激动人心的进展，而整合生物学-教育-医学的方法还有更多可提供的。结构生物学预计将在理解噬菌体的宿主识别方面发挥主要作用，最近对噬菌体Bxb1和Douge的冷冻电镜（CryoEM）和冷冻电子断层扫描（CryoET）结构显示了什么是可能的。拥有如此大的噬菌体库和结构蛋白的巨大多样性，可以预期在不久的将来会出现许多额外的噬菌体结构，为宿主识别提供结构见解。可能会出现额外的惊喜，包括意想不到的蛋白质成分和病毒粒子蛋白的修饰，包括广泛的糖基化。这些结构将促进噬菌体工程化和设计具有新特异性的新噬菌体。

合成基因组学将为设计和构建具有新特异性和新效用（包括治疗）的噬菌体提供极大的灵活性。合成分枝杆菌噬菌体DNA片段可能具有挑战性，因为其G+C含量相对较高，但更新的合成技术为此提供了良好的解决方案。合成的DNA片段可以使用Golden Gate组装进行组装，并通过电穿孔到耻垢分枝杆菌中重新启动。单个DNA片段可以容易地修饰并用于构建不同的噬菌体变体，主要限制于我们对可能性的想象力。合成40至80 kbp范围内的dsDNA有尾噬菌体基因组仍然相当昂贵，但随着技术的进步和更广泛的使用，成本将会降低。简单、廉价的全基因组合成也将能够构建仅具有生物信息学数据的噬菌体。

机器学习和人工智能在功能基因组学中扮演着关键角色，并有望阐明生物圈的噬菌体“暗物质”。在分枝杆菌噬菌体基因组中，有超过200,000个功能未知的基因，代表了超过20,000个不同的基因家族。其中许多可能影响细菌-噬菌体军备竞赛，在溶原性中防御噬菌体感染或在裂解生长中排斥噬菌体，或者作为抗防御系统来对抗细菌免疫系统。使用AlphaFold预测蛋白质结构以及蛋白质-蛋白质相互作用的能力将在解决这些问题方面产生变革，并为测试有关基因功能的具体假设提供计算动力。合成基因组学和结构见解将为这些预测提供实验证据。

最后，采用iREC结构的科学教育项目将继续丰富我们对噬菌体多样性和进化的知识。生物圈中的噬菌体比学生多，巨大的多样性表明还有更多有待发现。感染节杆菌、棒状杆菌、戈登菌、链霉菌、微杆菌和红球菌菌株的噬菌体的比较基因组学显示出与分枝杆菌噬菌体相似的复杂性，并且在放线菌门内还有数百或数千其他物种和菌株，即使在这个相当狭窄的系统发育空间内，关于这些噬菌体还有太多需要了解。从第一个测序的分枝杆菌噬菌体，到本科生实验室，再到惠及患者，这段旅程说明了整合好奇心驱动的科学、包容性教育和有效的转化如何能够推动21世纪的微生物学发展。