体细胞XIST缺失对X染色体失活维持机制的影响：逃逸基因的表观遗传调控新发现

《Human Molecular Genetics》：Impact of somatic XIST deletions on ongoing XIST expression and inactive X silencing and heterochromatin

本研究针对X染色体失活(XCI)维持机制中XIST lncRNA的功能缺失影响展开深入探索。研究人员通过CRISPR/Cas9技术构建XIST基因不同功能域缺失的hTERT RPE-1细胞模型，发现A重复区域对XIST持续表达至关重要，而E重复区域影响RNA定位。XIST缺失导致逃逸基因（如MED14和USP9X）表达上调，并伴随H3K27me3和H2AK119ub等异染色质标记的丢失。值得注意的是，单独抑制这些表观遗传通路并不能完全模拟XIST缺失效应，表明XCI维持需要多种沉默通路的协同作用。该研究为理解癌症和衰老中XIST表达异常的分子机制提供了重要线索。

　　

在女性哺乳动物细胞中，X染色体失活（XCI）是维持基因剂量平衡的关键机制。长链非编码RNA XIST在这一过程中扮演着核心角色，它能够引导一条X染色体转化为异染色质状态，即巴氏小体。然而，这一沉默机制并非绝对有效——约20%的X连锁基因能够"逃逸"这种失活作用，这些逃逸基因往往编码重要的转录因子和染色质调节因子，其表达失调与多种疾病密切相关。

随着研究的深入，科学家发现XIST表达异常与癌症发生和衰老过程存在显著关联。在肿瘤细胞中经常观察到XIST表达下调，而衰老细胞中则出现XCI缺陷现象。这些发现引出了一个关键科学问题：在发育成熟后的体细胞中，XIST是否仍然对XCI维持具有重要作用？尽管早期研究表明XCI在体细胞中具有稳定性，即使XIST缺失也能维持，但近年来的研究提示XIST可能通过调节表观遗传状态来抑制逃逸基因的表达。

为了解答这一问题，不列颠哥伦比亚大学医学遗传学系的Karanveer S. Bhangu等研究人员在《Human Molecular Genetics》上发表了最新研究成果。他们选择hTERT RPE-1这一非癌性视网膜成纤维细胞系作为模型，通过精确的基因编辑技术系统性地删除了XIST基因的不同功能区域，深入探究了XIST缺失对基因表达和染色质结构的全方位影响。

研究团队主要运用了几项关键技术方法：利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建XIST不同功能域的缺失细胞系；通过RNA-seq进行转录组分析，比较野生型与突变型细胞的基因表达差异；采用免疫荧光-RNA FISH（荧光原位杂交）联用技术分析XIST定位与组蛋白修饰共定位；通过等位基因特异性表达分析和焦磷酸测序评估Xi（失活X染色体）来源的基因表达变化；利用蛋白质印迹法验证化学抑制剂对特定组蛋白修饰的抑制效果。

内部调控区域对XIST转录至关重要

研究人员首先对XIST基因进行了精细的缺失图谱分析，构建了覆盖A-F重复区域在内的多种缺失突变体。结果显示，缺失包含A重复区域的△AC和△A完全消除了XIST表达，而缺失F重复区域的△F则使XIST表达降至野生型的约25%。其他区域如△Bh、△BC、△e4和△e5的缺失对XIST表达影响较小。特别值得注意的是，缺失E重复区域虽然不影响XIST转录，但导致XIST RNA在核内分散分布，失去了正常的定位能力。这些发现表明XIST基因内部存在多个调控元件，其中A和F区域对维持正常表达水平尤为关键。

XIST转录缺失影响X连锁基因和常染色体基因

转录组分析揭示，完全缺失XIST的△AC细胞与野生型细胞在基因表达谱上存在明显差异。77个X连锁基因和2576个常染色体基因表现出显著表达变化。进一步分析发现，逃逸基因和可变逃逸基因在XIST缺失后表达平均增加16%-26%，而通常受XCI沉默的基因则未出现一致性变化。与之前在不同细胞系中的研究相比，本研究鉴定出22个 recurrently XIST依赖性上调基因，其中6个基因（CDK16、USP9X、RAB9A、RBBP7、MED14和MIR222HG）在三个以上研究中均被确认。

等位基因分析证实XIST缺失导致基因重新激活

通过等位基因特异性表达分析，研究人员直接证明了Xi来源的基因表达增加。逃逸基因USP9X和DDX3X在XIST缺失后几乎达到与Xa（活跃X染色体）相当的表达水平，而可变逃逸基因MED14则从几乎完全沉默状态转变为接近完全激活。值得注意的是，这些重新激活的基因共同特征是启动子区域缺乏DNA甲基化，支持了DNA甲基化缺失使基因更容易受XIST依赖性调控的假设。

XIST与染色质变化的相互作用

XIST缺失导致异染色质标记H3K27me3和H2AK119ub的显著减少，这两种修饰在野生型细胞中与XIST焦点共定位。然而，当研究人员单独抑制这些表观遗传通路时，发现仅抑制H3K9me3能部分激活USP9X表达，而对MED14无效。其他抑制剂（针对PRC1、PRC2、SETD8和HDAC）均未能重现XIST缺失的效应，表明XIST依赖性沉默需要多种染色质修饰途径的协同作用，而非单一通路主导。

本研究系统阐明了XIST在体细胞中维持XCI的关键作用机制。研究发现XIST通过建立和维持特定的染色质状态，特别是对缺乏DNA甲基化的逃逸基因施加"刹车"效应，限制其从Xi的表达。这种调控具有基因特异性和细胞类型特异性，可能由多种沉默通路组合实现。

这些发现对理解女性特异性疾病和性别差异相关病理现象具有重要意义。XIST表达异常见于多种癌症，而随着年龄增长出现的XCI缺陷可能与老年女性特定疾病易感性相关。另一方面，针对XIST的调控也可能为X连锁显性遗传病（如Rett综合征）提供治疗思路。该研究不仅深化了对X染色体失活维持机制的理解，也为相关疾病的机制研究和治疗策略开发提供了重要理论基础。