尿液蛋白质组学揭示新月体肾炎新型生物标志物：凝血因子V与磷脂转移蛋白的诊断价值

《Clinical Kidney Journal》：Novel biomarkers of crescentic glomerulonephritis identified by urinary proteomics

本研究针对新月体肾炎（CrGN）病理诊断依赖肾活检、缺乏无创标志物的临床难题，通过数据非依赖性采集（DIA）蛋白质组学技术筛选尿液生物标志物。研究发现凝血因子V（F5）和磷脂转移蛋白（PLTP）可有效区分CrGN与其他肾病（AUC分别达0.780和0.831），并揭示中性粒细胞脱颗粒、补体级联反应和neddylation通路激活为CrGN关键机制。该成果为CrGN无创诊断提供了新策略，对指导临床及时干预具有重要意义。

　　

在肾脏病学领域，新月体肾炎（Crescentic Glomerulonephritis, CrGN）如同一场突如其来的风暴，患者肾功能可在数周内急剧恶化，迅速进展至终末期肾病。这种疾病的病理特征表现为肾小球内超过50%的新月体形成——这些"新月"实际上是肾小囊内细胞增生和炎症细胞浸润的结果。临床实践中，肾穿刺活检是诊断CrGN的"金标准"，但这项有创操作常因患者出血风险、凝血功能障碍或医疗条件限制而无法及时实施。更复杂的是，CrGN的病因多样，包括抗肾小球基底膜病（anti-GBM疾病）、ANCA相关性血管炎（AAV）、免疫复合物性肾炎等，其临床表现缺乏特异性，使得早期鉴别诊断尤为困难。

目前临床亟需能够替代肾活检的无创生物标志物。虽然已有研究探索尿液中的纤维母细胞特异性蛋白1（FSP1）、可溶性CD163（sCD163）等指标，但这些标志物或缺乏疾病特异性，或诊断效能有限。在这一背景下，中国医学科学院北京协和医院肾脏内科陈丽萌教授团队联合复旦大学附属中山医院，将目光投向了尿液蛋白质组学这一新兴领域。

研究人员创新性地采用数据非依赖性采集（Data-Independent Acquisition, DIA）蛋白质组学技术，这种技术能够对复杂样本中的数千种蛋白质进行无偏倚的全面检测。该研究于2022年5月至2023年4月在北京协和医院前瞻性招募了137名参与者，包括经肾活检证实的CrGN患者、急性肾损伤（AKI）患者、非新月体肾炎患者和健康对照。研究分为两个阶段：发现队列（55人）用于蛋白质组学筛选，验证队列（82人）用于酶联免疫吸附测定（ELISA）验证。

关键技术方法包括：1）临床样本采集与处理：收集晨尿中段尿样，离心后保存于-80°C；2）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析：使用Orbitrap Exploris480质谱仪进行DIA模式检测；3）生物信息学分析：通过DIA-NN软件进行蛋白质鉴定，采用IPA（Ingenuity Pathway Analysis）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库进行通路富集分析；4）生物标志物验证：使用ELISA技术检测尿液F5、PLTP和ADH1C水平，并以尿肌酐（Ucr）校正。

差异表达蛋白质筛选与通路分析

通过比较CrGN组与各对照组的尿液蛋白质组，研究人员发现了显著差异表达模式。当CrGN与健康对照组比较时，识别出944个差异表达蛋白质（Differentially Expressed Proteins, DEPs）；与肾炎对照组比较时，发现410个DEPs；与AKI组比较时，则有129个DEPs。经过严格筛选（错误发现率FDR<0.01且曲线下面积AUC>0.8），最终分别保留464、200和40个DEPs。

IPA通路分析揭示了CrGN的独特分子特征：与健康对照组和肾炎对照组相比，CrGN组最显著激活的通路是中性粒细胞脱颗粒和补体级联反应。而与AKI组相比，neddylation通路（一种蛋白质翻译后修饰过程）和NF-κB信号通路在CrGN中特异性激活。这些发现从分子层面解释了CrGN的炎症本质——中性粒细胞和补体系统的过度激活驱动了肾小球内炎症反应，而neddylation可能参与了炎症信号的调控。

关键生物标志物的发现与验证

通过维恩图分析三组比较中的共同DEPs，研究人员锁定了8个与CrGN密切相关的核心蛋白质。进一步筛选后，凝血因子V（F5）、磷脂转移蛋白（PLTP）和酒精 dehydrogenase 1C（ADH1C）脱颖而出，成为最具诊断潜力的标志物。

在验证队列中，ELISA检测结果证实了F5和PLTP的诊断价值：CrGN患者尿液F5/Ucr和PLTP/Ucr水平显著高于其他组别。值得注意的是，这两种标志物与肾小球新月体比例呈正相关（PLTP/Ucr：r=0.36，P<0.001；F5/Ucr：r=0.40，P<0.001），表明其水平可反映疾病严重程度。

ROC曲线分析显示，PLTP/Ucr诊断CrGN的AUC为0.831（95%CI：0.738-0.924），最佳截断值为620.76 pg/mmol时，敏感性和特异性分别为78.8%和81.6%；F5/Ucr的AUC为0.780（95%CI：0.679-0.881），截断值为20.19 pg/mmol时，敏感性为78.8%，特异性为67.3%。两者联合使用可将诊断效能提升至AUC=0.839。此外，F5/Ucr还对复合不良肾脏结局（包括终末期肾病、需要透析或eGFR下降≥50%）具有预测价值（AUC=1.01，P=0.043）。

机器学习模型的构建与应用

研究团队还构建了多层感知器（Multilayer Perceptron, MLP）神经网络模型，整合了发病至诊断时间间隔、血红蛋白、白蛋白、住院期间最高肌酐水平、尿红细胞（U-RBC）和尿液F5/Ucr比值等临床指标。该模型在训练集和验证集上分别实现了0.984和0.947的AUC值，准确率分别达到95.5%和72.7%，显示出良好的临床应用前景。

本研究的意义不仅在于发现了两个新型尿液生物标志物，更在于从分子层面揭示了CrGN的发病机制。F5作为凝血系统的关键成分，其升高反映了CrGN中肾小球内凝血激活和炎症反应；PLTP作为脂质转移蛋白，已知参与免疫炎症过程，本研究首次将其与CrGN联系起来。这些发现为理解CrGN的"通用通路"——即不同病因最终通过共同机制导致新月体形成——提供了新视角。

研究的局限性在于CrGN亚型分布不均（以III型为主），未来需要在更大样本中验证这些标志物在各亚型中的普适性。此外，标志物的生物学功能及其在CrGN中的具体作用机制尚需进一步探索。

这项发表于《Clinical Kidney Journal》的研究，为CrGN的无创诊断提供了新工具，有望在肾活检不可行的情况下，帮助临床医生及时识别这类急危重症肾脏病，为患者赢得宝贵的治疗时间。尿液蛋白质组学在肾脏疾病领域的应用，正展现出越来越广阔的临床前景。