疱疹病毒复制启始蛋白OBP的冷冻电镜结构揭示DNA识别与二聚化新机制

《Nucleic Acids Research》：The herpes simplex origin-binding protein: mechanisms for sequence-specific DNA binding and dimerization revealed by Cryo-EM

本研究针对单纯疱疹病毒(HSV-1)对现有DNA聚合酶靶向药物产生耐药性的临床挑战，通过冷冻电镜技术解析了病毒复制启始蛋白OBP的多种构象状态结构。研究人员发现OBP采用头对尾二聚体架构，其C端结构域形成主要二聚界面，并首次揭示了R756VKNL基序介导序列特异性DNA识别的分子机制。该研究鉴定出多个可药性界面，为开发靶向HSV-1 OBP的新型抗病毒药物奠定了结构基础。

　　

在全球约70%人口携带单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的背景下，免疫抑制患者中日益严重的抗病毒药物耐药性问题亟待解决。现有治疗方案主要靶向病毒DNA聚合酶，但耐药株的出现凸显了开发新作用机制药物的迫切性。HSV-1起源结合蛋白(Origin-binding protein, OBP)作为病毒DNA复制启始的关键蛋白，因其在复制最早阶段发挥作用而成为极具潜力的替代靶点。然而，自OBP发现四十年来，其三维结构一直未被解析，严重制约了针对该靶点的合理药物设计。

近日发表于《Nucleic Acids Research》的研究通过冷冻电镜技术突破了这一瓶颈，成功解析了HSV-1 OBP在多种功能状态下的高分辨率结构，包括与OriS识别序列复合物、与非水解ATP类似物ATPyS结合状态以及不同寡聚化形式的结构。这些结构为理解病毒DNA复制启始机制提供了前所未有的见解，同时揭示了多个可药性界面，为新型抗病毒药物开发开辟了道路。

研究人员主要采用冷冻电镜单颗粒分析技术，通过表达纯化HSV-1 UL9基因编码的OBP蛋白，将其与不同形式的OriS DNA底物（包括OriS-6AT寡聚体、完整OriS以及mini-OriS*）在体外重构复合物，利用300kV冷冻电镜收集高分辨率数据。采用RELION、cryoSPARC等软件进行数据处理和三维重构，最终获得2.8?至3.5?分辨率的结构模型。

头对尾二聚体架构揭示新型调控界面

研究首次揭示了OBP的头对尾二聚体结构，每个单体由N端解旋酶结构域(1-535位残基)和C端DNA结合结构域(536-851位残基)组成。出乎意料的是，主要二聚界面由C端结构域的三个α螺旋构成，而非此前认为的N端区域。更引人注目的是，每个单体的极端C端会穿入伙伴分子的N端结构域，形成广泛的分子间接触网络，这可能是一种新的功能调控机制。

ATP结合口袋保守基序及其与OBP C端相互作用的调控机制

在OBP+OriS+ATPyS复合物结构中，研究人员观察到ATP类似物和配位的Mg²⁺离子，揭示了核苷酸结合状态。ATPyS结合诱导了口袋下半部分的轻微闭合和基序I P-loop的移动。研究详细解析了SF1/SF2解旋酶特征的七个保守基序在ATP结合口袋中的空间排列，发现K87与ATPyS的α-和β-磷酸基团相互作用，这种排列方式与其他解旋酶存在明显差异。

二聚体伙伴C端穿线作为解旋酶功能的调控开关

结构分析揭示了一个意想不到的特征：每个单体的C末端穿入其伙伴分子，使其靠近另一个单体的ATP结合口袋。这种排列将C末端置于解旋酶基序Ia的R112和R113以及基序V附近。M842将基序V推离正常位置，与丙型肝炎病毒NS3等其他SF2解旋酶相比存在显著差异。这一发现为解释C端缺失突变体为何保持起源特异性结合却表现出增强的解旋酶活性提供了结构基础。

序列特异性起源识别的分子基础

高分辨率OBP+OriS-6AT结构揭示了保守R756VKNL基序与其靶标Box 1序列(GTTCGCAC)在DNA大沟中的详细相互作用。研究观察到两种类型的蛋白质-DNA接触：序列特异性碱基识别和磷酸骨架相互作用。K758通过主链羰基识别D/C26胞嘧啶的胺基，同时其侧链深入大沟与C/G53鸟嘌呤的羰基和D/G27鸟嘌呤的N7形成氢键。这些相互作用解释了OBP如何区分不同结合位点的分子机制。

保守基序功能的结构新见解

研究还重新定义了多个保守元件的功能。保守F553XXKYL基序中的E555与伙伴单体的R607形成盐桥，表明该基序主要功能是维持二聚体完整性而非直接参与DNA识别。位于结构顶点的PEST序列(265-282位残基)暴露在柔性环上，这为病毒复制周期中蛋白质降解的调控机制提供了线索。

多种寡聚状态指示起源激活过程中的动态组装

为研究单链DNA对OBP结构和功能的影响，研究人员解析了OBP与带有3'dT₁₀尾的mini-OriS*复合物的结构。出乎意料的是，OBP在该复合物中采用单体构象，与OriS DNA观察到的头对尾二聚体形成鲜明对比。尽管存在技术挑战，该结构揭示了与二聚体状态相比的显著构象变化。此外，研究还捕获了两种不同的OBP二聚体高级组装形式，表明OBP能够形成非常规组装体，可能在复制起始过程中发挥特定功能。

研究结论与意义讨论

该研究提出的结构证据支持HSV-1 OriS起源激活的新模型：两个OBP二聚体协同结合到OriS的Box 1和Box 2臂上，正确 positioned 的二聚体可能诱导AT-rich间隔序列的弯曲和去稳定化。这种变形可能促进瞬时单链DNA的暴露，便于ICP8结合。ICP8相互作用进而可能释放自抑制的OBP C端延伸，导致ATP水解和OBP原体的进一步构象重排。这些转变可能启动有限解链并促进Box 3-Box 1发夹结构的形成。

从治疗角度看，OBP结构的解析为克服当前聚合酶靶向抗病毒药物耐药性提供了全新策略。研究特别强调了独特的DNA结合基序、二聚体形成相互作用以及与单链DNA结合蛋白ICP8的相互作用界面作为有前景的药物靶点。这些多样化的靶向选项通过提供全新的作用机制，有望帮助应对日益严重的HSV-1耐药性挑战。

综上所述，该研究不仅深化了对HSV-1复制起始基本机制的理解，而且为治疗干预提供了新的可能性。观察到的复杂结构转变和调控机制阐明了病毒生物学的关键方面，并为开发下一代抗病毒治疗指明了有前景的方向。这些见解为对抗耐药性HSV-1感染提供了关键基础，甚至可能扩展抗病毒治疗以预防疱疹病毒感染后的继发疾病。