NnMYC2-NnMYB14-NnCYP80模块协同调控荷花（Nelumbo nucifera）中苄基异喹啉生物碱的空间分布机制

《Horticulture Research》：Spatial regulation of benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis in lotus (Nelumbo nucifera) is controlled coordinately through the NnMYC2-NnMYB14-NnCYP80 modules

本研究针对荷花中苄基异喹啉生物碱（BIA）在叶片和胚芽中空间分布差异的调控机制问题，通过全基因组筛选发现串联排列的组织特异性NnCYP80G（叶中表达）和NnCYP80A（胚芽中表达）基因，并解析其分别催化阿朴啡型BIA和双-BIA合成的功能。进一步鉴定出JA信号通路核心转录因子NnMYC2通过直接激活NnMYB14表达，进而共同调控NnCYP80G/A的表达，首次揭示荷花BIA器官特异性积累的分子模块。该研究为荷花药用成分的定向调控提供了理论依据，对植物次生代谢的空间调控机制研究具有重要启示意义。

　　

在植物王国中，苄基异喹啉生物碱（Benzylisoquinoline Alkaloids, BIA）是一类具有显著药理活性的次生代谢产物，如镇痛药吗啡、抗癌药物诺斯卡品等。荷花（Nelumbo nucifera）作为中国广泛栽培的水生作物，其叶片和胚芽中富含具有抗氧化、抗肥胖、抗病毒等功效的BIA成分。有趣的是，荷花叶片主要积累阿朴啡型BIA（如荷叶碱），而胚芽则富含双-BIA（如莲心碱），这种器官特异性分布的分子调控机制长期以来悬而未解。

为了揭示这一科学问题，中国科学院武汉植物园邓显宝研究员和杨梅研究员团队在《Horticulture Research》上发表了最新研究成果。研究团队通过全基因组筛选发现荷花中存在6个CYP80基因，其中串联排列于2号染色体的NnCYP80G和NnCYP80A分别特异表达于叶片和胚芽，与阿朴啡型和双-BIA的积累模式高度吻合。酶活实验证实NnCYP80G具有阿朴啡合酶活性，能催化(R)-网状紫堇碱生成斑鸠菊碱；NnCYP80A则专一性催化(R)-N-甲基乌药碱生成双-BIA莲碱。进一步研究发现茉莉酸（JA）信号通路核心转录因子NnMYC2通过直接结合NnMYB14启动子激活其表达，而R2R3型MYB转录因子NnMYB14又能直接结合NnCYP80G和NnCYP80A启动子，正调控它们的表达。

研究采用的关键技术包括：基于T2T基因组的P450基因全基因组筛选、RT-qPCR时空表达分析、农杆菌介导的烟草瞬时表达系统、UPLC-MS/MS代谢物检测、双荧光素酶报告基因检测、酵母单杂交（Y1H）和电泳迁移率变动分析（EMSA）等分子互作验证技术，以及荷花花瓣瞬时过表达实验。实验材料主要使用荷花品种'建选17'和'秋星'，其中'建选17'用于BIA积累和基因表达分析，'秋星'用于瞬时过表达实验。

Mining of CYP80s involved in the lotus BIA biosynthesis

通过全基因组分析发现荷花有222个P450基因，其中6个属于CYP80家族。系统进化分析显示NnCYP80G和NnCYP80A与已鉴定的BIA相关CYP80聚为一支，且两者串联排列于2号染色体，间隔约19kb。表达谱分析表明NnCYP80G主要在叶片表达，NnCYP80A特异在胚芽表达，与代谢物积累模式一致。

The NnCYP80G and NnCYP80A expression was positively correlated with BIA accumulations

RT-qPCR分析显示NnCYP80G在叶片发育第4期表达最高，NnCYP80A在授粉后15天胚芽中表达峰值。启动子-GUS转基因拟南芥实验证实NnCYP80G启动子在绿色组织活跃，NnCYP80A启动子在幼种子特异表达。亚细胞定位显示两个蛋白均定位于内质网。

The functions of NnCYP80G and NnCYP80A were diverged

烟草瞬时表达系统证明NnCYP80G能催化(R)-网状紫堇碱生成斑鸠菊碱（转化率85%），(R)-N-甲基乌药碱生成格拉西奥文（转化率56%）；NnCYP80A专一性催化(R)-N-甲基乌药碱生成莲碱（转化率16%）。荷花花瓣过表达NnCYP80A使莲心碱和莲碱含量显著提高2.41-2.88倍。

NnMYC2 positively regulates the NnCYP80G and NnCYP80A expression

MeJA和机械损伤处理能诱导proNnCYP80G:GUS表达，但对proNnCYP80A:GUS无影响。过表达NnMYC2能激活两个启动子（2.2-4.2倍），但不直接结合启动子。花瓣过表达NnMYC2特异性上调NnCYP80G表达和阿朴啡BIA积累，对NnCYP80A无影响。

NnMYB14 positively regulates the NnCYP80G expression

NnMYB14具有器官特异性表达模式，且受MeJA诱导。双荧光素酶、Y1H和EMSA实验证明NnMYB14直接结合NnCYP80G/A启动子中的MBS位点。花瓣过表达NnMYB14显著提高阿朴啡BIA含量1.84倍，但对双-BIA无影响。

NnMYB14 is a direct target of NnMYC2

NnMYC2能直接结合NnMYB14启动子中的G-box/E-box元件并激活其表达。胚芽MeJA处理显著诱导NnMYC2和NnMYB14表达，强烈上调NnCYP80G（8.2倍）和阿朴啡BIA积累（10倍），对NnCYP80A和双-BIA调控较弱。

研究结论表明，荷花BIA的空间分布受NnMYC2-NnMYB14-NnCYP80模块的协同调控：环境胁迫通过JA信号激活NnMYC2，进而直接调控NnMYB14表达；NnMYB14直接激活组织特异性表达的NnCYP80G（叶）和NnCYP80A（胚芽），分别催化阿朴啡型和双-BIA合成。该研究首次阐明了荷花BIA器官特异性积累的分子机制，不仅为荷花药用成分的定向改良提供了靶点基因，也为植物次生代谢物的空间调控网络研究提供了新模式。值得注意的是，NnCYP80A的胚芽特异性表达可能受其他未知因子严格调控，这为后续研究留下了重要科学问题。