艾司氯胺酮通过GPR109A依赖的神经炎症抑制改善帕金森病小鼠抑郁样行为

《Brain Research Bulletin》：Esketamine Relieves Depressive-like Behaviors in MPTP-induced Parkinson Disease mice via GPR109A-dependent Reduction of Neuroinflammation

本研究针对帕金森病(PD)常见并发症抑郁症状，探讨了单剂量艾司氯胺酮(esketamine)通过激活G蛋白偶联受体109A(GPR109A)减轻MPTP诱导的PD小鼠抑郁样行为的作用机制。研究发现艾司氯胺酮可显著改善行为绝望和快感缺失，上调内侧前额叶皮层(mPFC)GPR109A表达，降低促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，而GPR109A拮抗剂MPN可逆转上述效应，表明GPR109A信号通路在艾司氯胺酮抗抑郁作用中起关键介导作用，为PD相关抑郁提供了新的治疗靶点。

　　

帕金森病作为第二大 neurodegenerative disease（神经退行性疾病），不仅以运动症状为特征，其非运动症状同样严重影响患者生活质量。其中，抑郁症状在帕金森病患者中发生率高达40%-50%，却往往被忽视或治疗不足。传统抗抑郁药物起效慢，且对帕金森病相关抑郁的疗效有限，因此，探寻起效快、作用机制新颖的治疗策略成为当务之急。神经炎症，特别是大脑关键情绪调节区域——内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex, mPFC)的炎症，被普遍认为是帕金森病抑郁症状的重要病理基础。小胶质细胞(microglia)作为中枢神经系统的免疫主力，其过度活化释放的大量促炎细胞因子(pro-inflammatory cytokines)，如肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1 beta, IL-1β)和白介素-6(Interleukin-6, IL-6)，如同“炎症风暴”，破坏神经环路功能，直接参与抑郁的发生。近年来，G蛋白偶联受体109A(G protein-coupled receptor 109A, GPR109A，亦称烟酸受体或羟基羧酸受体2)在免疫调节和神经保护中的作用逐渐受到关注，尤其是在小胶质细胞中表达，其激活被证明可以抑制神经炎症反应，成为一个潜在的治疗靶点。另一方面，艾司氯胺酮(esketamine)，作为氯胺酮的S-对映体，因其快速抗抑郁效应已获美国FDA批准用于治疗难治性抑郁。除了经典的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)拮抗作用，其是否通过其他途径，特别是抗炎机制发挥疗效，尤其是在帕金森病背景下，尚不清楚。猜想艾司酮胺酮可能通过调控GPR109A来发挥其抗炎和抗抑郁作用，是一个值得深入探索的科学问题。

为了验证这一科学假设，研究团队发表在《Brain Research Bulletin》上的这项研究，开展了一系列严谨的实验。研究主要采用了MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)诱导的帕金森病小鼠模型，该模型能模拟帕金森病的多巴胺能神经元丢失和部分非运动症状。研究人员对小鼠进行了详细的行为学评估，包括强迫游泳试验(forced swim test, FST)、悬尾试验(tail suspension test, TST)和蔗糖偏好试验(sucrose preference test, SPT)，用以量化抑郁样行为（行为绝望和快感缺失）。同时，也通过转棒试验(rotarod test)和杆试验(pole test)评估了运动功能，以区分抑郁样行为与运动障碍。在分子机制层面，研究运用了蛋白质印迹(Western blot)技术检测mPFC脑区内GPR109A及促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达水平。通过免疫荧光染色(immunofluorescence staining)观察GPR109A在小胶质细胞（标记物为Iba1）中的表达和定位，并利用流式细胞术(flow cytometry)进一步精确定量分析小胶质细胞表面GPR109A的表达强度。为了确证GPR109A的功能必要性，研究使用了其选择性拮抗剂mepenzolate bromide (MPN)进行药理学阻断实验。样本来源于南京医科大学姑苏学院的实验动物中心。

3.1. 评估MPTP诱导的PD小鼠多巴胺能神经元丢失、运动功能缺陷和抑郁样行为

研究首先成功建立了MPTP诱导的帕金森病小鼠模型。免疫荧光和蛋白质印迹结果均证实，与生理盐水对照组相比，MPTP处理组小鼠黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNpc)的酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase, TH)⁺多巴胺能神经元数量显著减少，TH蛋白表达水平明显降低。行为学测试显示，MPTP小鼠在转棒仪上的停留时间缩短，完成杆试验所需时间延长，表明存在明显的运动协调障碍。更重要的是，在抑郁样行为测试中，MPTP小鼠在FST和TST中的不动时间显著延长，同时在SPT中对蔗糖溶液的偏好度显著降低。这些结果综合表明，MPTP处理不仅诱导了帕金森病典型的运动症状和多巴胺能神经元损伤，还成功诱发了抑郁样行为，为后续研究提供了可靠的疾病模型。

3.2. MPTP处理小鼠mPFC呈现显著神经炎症且GPR109A表达升高与抑郁样行为相关

研究人员将焦点转向与情绪调节密切相关的mPFC脑区。蛋白质印迹分析发现，MPTP小鼠mPFC中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白水平均显著高于对照组。同时，MPTP组小鼠mPFC中GPR109A的蛋白表达也显著上调。免疫荧光定量分析进一步证实了mPFC中GPR109A阳性细胞数量的增加。相关性分析揭示了有趣的关联：mPFC中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平分别与小鼠在FST和TST中的不动时间呈显著正相关。这表明mPFC的神经炎症程度与抑郁样行为的严重性密切相关，而GPR109A的上调可能是机体应对炎症应激的一种反应。

3.3. PD模型小鼠mPFC内小胶质细胞中GPR109A表达显著上调

为了明确GPR109A的细胞来源，研究通过免疫荧光双标技术进行了深入探究。结果清晰显示，在MPTP小鼠的mPFC中，小胶质细胞标记物Iba1与GPR109A存在明显的共定位，且GPR109A⁺/Iba1⁺双标细胞的数量显著多于对照组。蛋白质印迹也显示MPTP组mPFC中小胶质细胞标志物Iba1蛋白表达增加，提示小胶质细胞活化。流式细胞术分析进一步定量证实，从MPTP小鼠mPFC分离出的CD11b⁺CD45^low小胶质细胞群体中，GPR109A的 median fluorescence intensity (MFI, 中位荧光强度) 显著升高。这些结果汇聚成一个关键结论：在帕金森病模型小鼠的mPFC中，GPR109A的表达上调主要发生在被激活的小胶质细胞上。

3.4. 艾司氯胺酮对PD小鼠的抗抑郁效应与调控mPFC中GPR109A及炎症介质相关

接下来，研究探讨了艾司氯胺酮的干预效果。在MPTP造模后，给予单次剂量的艾司氯胺酮（10 mg/kg）处理。行为学测试结果表明，艾司氯胺酮处理显著逆转了MPTP引起的行为异常：小鼠在FST和TST中的不动时间明显缩短，在SPT中的蔗糖偏好度也恢复至接近正常水平。在分子水平上，艾司氯胺酮处理不仅进一步升高了mPFC中GPR109A的蛋白表达，还显著降低了MPTP诱导升高的IL-1β、IL-6和TNF-α水平。这表明艾司氯胺酮的抗抑郁作用可能与其上调GPR109A并进而抑制神经炎症有关。

3.5. GPR109A受体介导艾司氯胺酮的抗抑郁作用

为了直接验证GPR109A是否是艾司氯胺酮发挥作用的关键媒介，研究引入了GPR109A激动剂Monomethyl Fumarate (MMF)和拮抗剂MPN进行药理学验证。实验设置了四组MPTP模型小鼠：分别接受艾司氯胺酮(ESK)、MMF、艾司氯胺酮联合MPN(MPN+ESK)以及溶剂对照。结果令人信服：无论是艾司氯胺酮还是MMF处理，都能显著改善MPTP小鼠的抑郁样行为（减少FST/TST不动时间，提高蔗糖偏好），并降低mPFC中促炎细胞因子水平，同时升高GPR109A表达。然而，当同时给予GPR109A拮抗剂MPN时，艾司氯胺酮的所有有益效应——包括行为学改善、抗炎作用以及GPR109A的上调——均被完全阻断。MMF作为GPR109A激动剂，模拟了艾司氯胺酮的效果，而MPN则特异性阻断了艾司氯胺酮的作用。这些证据强有力地表明，艾司氯胺酮的抗抑郁和抗炎作用的确依赖于GPR109A受体的激活。

研究的讨论部分对上述发现进行了深入阐释。首先，强调了帕金森病相关抑郁的高患病率及其对患者生活质量的严重影响，突出了本研究的临床相关性。其次，详细讨论了神经炎症，特别是mPFC区域的炎症，在帕金森病抑郁病理生理中的核心地位，为本研究的靶点选择提供了理论依据。关于艾司氯胺酮，讨论中指出其快速抗抑郁作用通常归因于NMDA受体拮抗，但本研究揭示了其一种不依赖于NMDA受体的重要新机制——通过GPR109A介导的抗炎通路。GPR109A作为一个新兴的免疫调节靶点，其激动剂如烟酸（niacin）在代谢和炎症性疾病中已有研究，本研究将其与快速抗抑郁药物艾司氯胺酮联系起来，拓展了对二者作用机制的认识。通过巧妙的拮抗剂实验，研究确证了GPR109A在介导艾司氯胺酮效应中的必要性，使得机制阐释更加清晰。

当然，研究也坦诚地指出了其局限性。例如，使用的急性MPTP模型不能完全模拟人类帕金森病的慢性进展特点；实验仅使用了雄性小鼠，未能探讨潜在的性别差异；艾司氯胺酮在小鼠和人体内的药代动力学可能存在差异；GPR109A下游的具体信号通路及其与NMDA受体阻断等其他已知艾司氯胺酮作用途径的交叉对话仍有待阐明；虽然药理学证据强烈支持小胶质细胞GPR109A的核心作用，但未来利用细胞特异性敲除模型将能提供更直接的因果证据。尽管存在这些局限，本研究的数据仍然坚实可靠，为理解艾司氯胺酮的作用机制提供了新的重要视角。

综上所述，本研究系统性地证实了单次注射艾司氯胺酮能够快速缓解MPTP诱导的帕金森病小鼠的抑郁样行为。其作用机制与上调mPFC脑区内小胶质细胞的GPR109A表达，进而抑制局部神经炎症密切相关。关键性的药理学阻断实验证明，GPR109A的激活是艾司氯胺酮发挥抗抑郁和抗炎效应的必要条件。这些发现不仅揭示了艾司氯胺酮一种新的作用机制，更重要的是，将GPR109A确立为帕金森病相关抑郁治疗的一个潜在新靶点，为开发针对这一棘手临床问题的快速起效疗法提供了重要的 preclinical（临床前）科学依据和新的思路。未来针对GPR109A靶点的药物研发，或许能为饱受帕金森病和抑郁双重折磨的患者带来新的希望。