工程化溶瘤细菌作为精准癌症治疗的设计策略与转化前景

《Protein & Cell》：Engineering oncolytic bacteria as precision cancer therapeutics: design principles, therapeutic strategies, and translational perspectives

为解决传统癌症疗法靶向性差、毒副作用大的问题，研究人员开展工程化溶瘤细菌在肿瘤治疗中的应用研究。通过合成生物学技术构建可感应外源信号（化学/物理）、细菌自身信号（群体感应）和肿瘤微环境信号（缺氧/低pH/乳酸）的基因回路，实现治疗载荷的时空可控释放。研究证实该策略可显著增强抗肿瘤疗效并降低脱靶毒性，为细菌介导的精准癌症治疗提供新范式。

　　

癌症至今仍是全球主要死亡原因，其发病率持续上升。传统细胞毒性疗法虽能有效杀灭癌细胞，却因对健康组织的 collateral damage（ collateral damage）导致严重副作用。分子靶向治疗和免疫治疗的进展推动了精准肿瘤学发展，但临床应用仍受限于肿瘤类型适用性窄、获得性耐药和治疗相关毒性等问题。免疫治疗通过调节宿主免疫系统识别清除癌细胞，但许多肿瘤因实体瘤物理屏障致免疫细胞浸润不足、细胞因子释放综合征（CRS, Cytokine Release Syndrome）以及脱靶效应等挑战而产生耐药。

与传统药物通过被动扩散积累不同，活细菌能主动穿透肿瘤深部，绕过血管附近聚集。肿瘤微环境（TME, Tumor Microenvironment）的独特特性使细菌优先在肿瘤内复制定植，如沙门氏菌在肿瘤中的密度可达正常组织的10,000倍以上。活细菌通过固有肿瘤靶向能力放大抗肿瘤效果，增强特异性免疫识别。然而，平衡细菌逃逸宿主抗菌防御与在TME内刺激抗肿瘤免疫仍具挑战。

合成生物学进步使得通过减毒毒力因子和整合可定制治疗载荷来合理设计优化溶瘤细菌菌株成为可能。精细调控细菌治疗活性的时空控制对于最大化药物积累、提高资源效率和减少对健康组织伤害至关重要。工程化溶瘤细菌常利用调控基因表达系统，整合特定启动子元件，实现体内治疗载荷递送的精确控制。

本研究综述了用于溶瘤细菌介导肿瘤治疗的可控基因表达策略，将遗传控制系统分为三类：外源信号触发（响应外源刺激）、细菌自身触发（依赖内在细菌信号机制）和病理信号激活（响应肿瘤特异性微环境线索）。文章还概述了桥接临床前发现和临床应用的机会与挑战，并讨论了提升其治疗潜力的未来方向。

研究人员主要采用以下关键技术方法：1）构建诱导型基因表达系统（如化学诱导、光遗传学、温度响应和辐射诱导系统）；2）设计自主感应回路（包括群体感应、一氧化氮响应和侵袭/细胞内生态位响应回路）；3）开发肿瘤微环境响应电路（感应缺氧、酸度、乳酸和基质金属蛋白酶等信号）；4）利用临床样本验证（包括小鼠皮下肿瘤模型、转移瘤模型和患者来源的异种移植模型）；5）结合多模态成像技术实时监测细菌分布和治疗效果。

外源输入响应基因回路

外部线索能够在所需位点或时间按需激活治疗基因。多样化外源刺激包括化学信号、物理信号（光、温度和辐射），可远程调控细菌基因回路。此类系统具有多重优势：精确的时间控制、系统循环期间代谢负担降低以及剂量可滴定激活的安全性提升。

小分子响应回路利用操纵子模型，其中阻遏蛋白与特定DNA序列结合，响应添加的化学分子调控细菌基因表达。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、L-阿拉伯糖、鼠李糖、四环素和水杨酸盐等化学诱导剂已用于控制细菌转基因表达以进行抗肿瘤应用。尽管IPTG触发系统广泛使用，但其存在固有局限性，包括诱导剂递送效率低、基因表达基础泄漏、宿主代谢负担增加和潜在细胞毒性。L-阿拉伯糖诱导系统提供更严格的调控，但表达效率中等。L-鼠李糖诱导系统需失活鼠李糖分解代谢基因和组成型表达转运蛋白。四环素系统依赖抗生素，可能破坏细菌活力并引发抗生素耐药性担忧。乙酰水杨酸（ASA）诱导系统代表有前景的替代方案，但其组织穿透性差和复杂药效学限制临床应用。

光响应回路通过光敏蛋白与调控元件结合实现转录精确调控。蓝光诱导系统（如EL222和pDawn）广泛用于细菌肿瘤治疗，但存在组织穿透性受限和潜在光毒性问题。上转换纳米颗粒（UCNPs）可将近红外（NIR）光转换为蓝光，实现深部组织光遗传学激活。红光响应系统（如Cph1/OmpR和iLight）转录激活效率低且需持续照明。远红光传感器（如RfpABC）提供高动态范围，但需与分裂酶结合开发新一代红光诱导系统。

温度响应回路利用超声波和磁场将机械能转化为热量，通过温度敏感遗传元件触发细菌基因表达。热诱导启动子（如P_L/P_R）和温度敏感阻遏蛋白（如TcI42和cI857）可在42-45°C激活基因表达，但可能造成健康组织热损伤。单歌系统（SINGER）使用TlpA39阻遏蛋白，在39°C高温下响应，实现更优可控性和敏感性。超声相关技术（如PET和MRI）可与细菌整合改善原位肿瘤可视化。

辐射响应回路利用辐射穿透能力强特性，激活DNA损伤响应启动子（如P_RecA和P_RecN），实现基因表达的空间时间控制同时最小化系统毒性。RecA或RecN与单链DNA形成复合物，触发阻遏蛋白自蛋白水解并启动转录。CheO盒整合可显著提高照射后mTNF-α分泌。P_RecN启动子基础活性较低，更适合肿瘤治疗应用，但其仍存在基础泄漏问题，深部肿瘤需高能辐射可能增加周围健康组织损伤风险。

自主细菌信号响应基因回路

这类系统将细菌固有生物过程（如群体通信和宿主互作响应）重新用于精确治疗触发，利用在TME内选择性放大的内源细菌信号。

群体感应（QS）驱动回路通过扩散信号分子积累调节群体密度依赖性行为。当这些分子达到一定浓度，它们与调控蛋白互作诱导QS启动子的靶基因表达。最广泛使用的QS系统来自费氏弧菌，包含转录调节因子LuxR、信号分子酰基高丝氨酸内酯（AHLs）合成酶LuxI以及携带P_luxR和P_luxI启动子的luxR-luxI基因间区。同步裂解电路（SLC）中噬菌体衍生的裂解基因在QS控制下表达，用于肿瘤治疗。AHL扩散到邻近细胞达到阈值群体密度时触发基因编码货物的释放。细菌裂解后，剩余细菌重新开始产生AHL，实现肿瘤内持续药物递送。SLC已用于释放多种治疗蛋白，包括CD47纳米抗体拮抗剂（CD47nb）、程序性死亡配体1（PD-L1）纳米抗体、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）纳米抗体、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子超家族成员14（TNFSF14）和趋化因子（如hCXCL13、CXCL16和CCL20），促进免疫细胞招募和激活，增强抗肿瘤免疫力。

一氧化氮响应回路基于调控蛋白NorR和P_norV启动子，响应增加的NO。无NO时，NorR与其在P_norV启动子内的结合位点互作，阻碍RNA聚合酶招募并抑制转录。NO结合后，NorR发生构象变化激活转录。该系统驱动DNA重组酶FimE表达，不可逆地翻转fimS开关以维持靶基因表达。

侵袭/细胞内生态位响应回路利用细菌独特侵入特性和细胞内生命周期为工程化新型肿瘤治疗方法提供机会。沙门氏菌使用3型分泌系统（T3SS）针状复合物跨越细菌内外膜向宿主细胞递送效应物。进入宿主细胞质后，沙门氏菌形成沙门氏菌包含液泡（SCV），细胞内代谢信号（如低pH和低磷酸盐）触发沙门氏菌致病岛2（SPI-2）和T3SS-2基因表达。T3SS针状复合物穿透SCV膜，使载荷蛋白分泌到宿主胞质溶胶中。细胞内递送（ID）系统基于沙门氏菌VNP20009，包含SPI-2特异性遗传电路（P_sseJ-lysE）。在肿瘤中，沙门氏菌自然侵入癌细胞，P_sseJ启动子激活lysE表达，导致细菌裂解并将组成型表达的治疗蛋白（如Casp-3、OVA）释放到感染细胞质中。共表达溶血素E（HlyE）可破坏SCV膜促进液泡逃逸。sifA基因缺失 destabilizes SCV膜，也增强细菌货物的递送效率。

肿瘤微环境响应基因回路

工程化细菌可智能解码肿瘤内病理信号，启动空间精确的治疗基因表达。该方法利用细菌先天感应机制 coupled with 合成基因回路，将肿瘤特异性微环境线索转导为局部抗癌响应。

缺氧响应基因表达系统基于富马酸和硝酸盐还原（FNR）样转录调节因子，天然存在于兼性厌氧菌如大肠杆菌和沙门氏菌中。缺氧条件下，FNR通过与[4Fe-4S]²⁺簇配位形成同型二聚体并结合回文DNA序列促进转录。常氧条件下，簇降解导致FNR二聚体解离为无活性单体，抑制转录。多种缺氧响应启动子（如P_pepT、P_pfkA、P_ansB、P_frs和P_adhE）受FNR转录调控。优化启动子变体（如HIP-1和FF+20）可增强缺氧表达同时最小化常氧泄漏。

酸度响应回路利用癌症细胞代谢重编程导致的酸性微环境。即使在常氧条件下，癌症细胞也显示Warburg效应，特征为葡萄糖消耗升高和乳酸生成，导致细胞外空间酸化，pH值通常为6.5-6.9。使用生物发光转座子报告陷阱筛选沙门氏菌中受五种pH敏感启动子（P_adiY、P_yohJ、P_STM1787、P_STM1791和P_STM1793）控制的基因。将P_STM1787启动子与志贺毒素表达耦合，证明细菌介导肿瘤特异性治疗策略的可行性。膜整合转录激活因子CadC及其cadBA操纵子在酸性培养基中显示活性增加。

乳酸响应回路利用有氧糖酵解副产物乳酸在实体瘤中显著增加的特性。正常血清乳酸水平为1.5-3 mmol/L，肿瘤内浓度升至10-30 mmol/L，坏死肿瘤核心可能超过50 mmol/L。乳酸缺乏条件下，LldR二聚体结合P_lldP启动子内的操作子位点O1和O2，形成四聚体抑制转录。乳酸存在时，O2处LldR二聚体解离，而O1处二聚体作为转录激活因子启动基因表达。谷氨酸棒杆菌LldR因对葡萄糖和厌氧条件不敏感而成为传感器设计首选。工程化沙门氏菌整合缺氧传感器（P_fepT启动子）和乳酸传感器（P_LldR启动子和LldR蛋白），编程与门电路使转基因表达仅在同时缺氧和乳酸升高时发生。

基质金属蛋白酶（MMPs）在TME中频繁过表达，成为有前景的肿瘤特异性分子线索。报告方法中，几种新抗原肽通过MMP可切割连接子附着到沙门氏菌外膜。肿瘤浸润后，工程化沙门氏菌响应升高的MMP水平释放新抗原，实现局部招募和淋巴细胞激活。工程化EcN表达MMPs敏感IL-15实现TME响应IL-15递送。与光热疗法结合，该系统通过促进抗原呈递细胞和T细胞招募以及T和自然杀伤细胞扩增放大抗肿瘤效果。

研究结论与意义

工程化活溶瘤细菌作为"微生物工厂"具有在肿瘤内持续产生多种治疗蛋白的潜力，使其更有效地对抗癌症。该策略成功取决于选择最优细菌底盘，因为不同菌株表现出独特特性，包括肿瘤特异性定植能力、固有溶瘤机制、免疫调节特性和遗传可操作性。通过临床前工程开发减毒细菌菌株实现优先肿瘤靶向最小化脱靶毒性。整合遗传编码回路进一步精确化，限制细菌激活或增殖到诱导型基因回路。治疗载荷可定制以满足不同肿瘤背景特定需求："热"肿瘤提供免疫调节剂（如细胞因子、肿瘤抗原）放大抗肿瘤免疫；"冷"肿瘤表达直接杀伤效应物（如毒素、凋亡蛋白）克服免疫浸润差。

报告基因（如荧光素酶、荧光蛋白）整合允许无创成像实时跟踪细菌分布和治疗效果，在单一平台集成治疗和诊断功能。逻辑门设计可增强肿瘤治疗精确性，如大肠杆菌Nissle 1917工程化在TME缺氧、低pH和高乳酸条件下释放溶血素，实施异或放大器靶向结直肠癌。与门电路确保治疗蛋白仅在乳酸和AHL同时存在时释放，最小化泄漏。

工程化活溶瘤细菌与其他抗肿瘤策略（如纳米材料、免疫检查点抑制剂和溶瘤病毒疗法）结合可增强治疗覆盖范围，克服单药治疗局限性并放大肿瘤杀伤能力。临床研究证明免疫疗法和化疗药物联合令人鼓舞的结果。智能纳米生物杂交体开发是有效癌症治疗的有前景研究领域。纳米材料可封装细菌作为药物工厂，同时整合纳米光敏剂或声敏剂用于协同治疗。纳米医学提高工程化细菌效率，细菌反过来增强纳米医学性能。工程化细菌代表通过重塑TME和改善免疫响应增强癌症免疫治疗的有前景策略。ICIs常受免疫细胞浸润差和高度免疫抑制TME限制。细菌基跨界联合疗法为改善CAR-T在实体瘤疗效提供有前景策略。溶瘤病毒特异性靶向、复制和破坏癌细胞，与细菌疗法结合显示 promise。

细菌外膜囊泡（OMVs）作为癌症治疗有效纳米药物递送系统出现。OMVs相比活细菌具有独特优势，包括增强的安全性特征降低感染风险，而某些天然OMVs介导有效抗肿瘤效果。OMVs已研究作为肿瘤抗原（Ag）递送疫苗。工程化OMVs可作为RNA递送系统，为各种RNA类型（包括mRNA、miRNA和siRNA）提供稳定性和持续递送。

合成生物学进步使细菌治疗剂配备提高的敏感性和处理正交输入的能力，为真正精准肿瘤学奠定基础。工程化细菌可编程优先积累在肿瘤中，重塑免疫微环境，并以严格时空控制释放治疗剂提高治疗效果同时最小化脱靶效应。这些特征将溶瘤细菌定位为响应性、模块化"活药物"并具有改善的安全性特征。同时，微生物组与癌症间复杂关系需要仔细考虑：虽然某些微生物可促进肿瘤 initiation 或转移扩散，阐明这些机制将为底盘选择、回路设计和患者分层提供信息。展望未来，转化成功将取决于稳健生物遏制（营养缺陷型、杀死开关、遗传防火墙）、可制造性和剂量标准化、减轻水平基因转移以及与免疫疗法和常规模式的合理组合。这些要素就位后，工程化细菌将有望提供更安全、更有效和个性化的癌症治疗。