环工程改造AtCas9实现高效广谱基因组编辑

《Cell Insight》：Loop Engineering of AtCas9 for effective and broad genome editing

本研究针对热稳定性Cas9在哺乳动物细胞中编辑效率低的问题，通过将嗜热AtCas9的表面暴露环替换为嗜温Nme1Cas9的对应序列，开发出Z7变体。该变体显著提高了核酸酶和碱基编辑效率，在镁限制条件下仍保持高DNA结合亲和力。分子动力学模拟显示Z7构象更稳定紧凑。进一步结合理性设计点突变获得Z7-E78-ABE，编辑效率较野生型提高5.76倍并扩展PAM识别范围，成功在原发性人T细胞中实现编辑。该环工程策略还可推广至GeoCas9和ThermoCas9，为非经典PAM位点编辑提供新工具。

　　

基因组编辑技术近年来飞速发展，其中CRISPR/Cas9系统因其可编程性和高效性成为生命科学领域的革命性工具。然而，尽管已有多种Cas9同源蛋白被发掘和应用，许多蛋白在真核细胞中的编辑效率仍不理想，这限制了它们在基因治疗等领域的应用。特别是那些来源于嗜热微生物的Cas9蛋白，虽然具有优良的热稳定性和较宽松的PAM识别特性，但在哺乳动物生理温度下活性较低，难以发挥其优势。

在这项发表于《Cell Insight》的研究中，研究人员聚焦于解决嗜热Cas9在哺乳动物细胞中编辑效率低的关键问题。他们创新性地提出了环工程策略，通过对蛋白质表面暴露的环区域进行理性设计，成功开发出具有显著改善编辑性能的AtCas9变体。

研究团队采用了多项关键技术方法开展研究。他们通过结构比对和理性设计，将嗜热AtCas9的特定环区域替换为嗜温Nme1Cas9的对应序列；利用分子动力学模拟分析蛋白质构象变化；通过体外生化实验评估蛋白质的酶活性和结合特性；在HEK293T和K562细胞系以及原代人类T细胞中进行基因组编辑效率验证；使用GUIDE-seq技术评估编辑特异性。这些方法的综合运用为研究结论提供了坚实支撑。

环工程增强嗜热AtCas9的编辑效率

研究人员首先发现嗜热AtCas9在55°C时表现出最佳切割活性，但在37°C时活性显著降低。通过结构比对发现，虽然嗜热和嗜温Cas9的核心区域保守，但环区域在序列保守性、长度和理化性质上存在显著差异。基于这一发现，研究团队将AtCas9的环替换为Nme1Cas9的对应序列，获得了V13变体，该变体在HEK293T细胞中三个基因组位点的碱基编辑效率比野生型平均提高了2.81倍。

进一步扩展环工程策略，研究人员生成了H1-H8系列变体，其中H1和H8表现出增强的碱基编辑活性。将H8环整合到V13+D1068K背景中产生了Z7变体，该变体在C-myc-41g、CTNNB1-10g和VEGFA-11g位点的编辑效率分别提高了3.88倍、2.61倍和9.48倍。评估显示，At-Z7-ABE在18个靶位点的编辑效率中位数提高了5.15倍，At-Z7-CBE效率提高了14.42倍，核酸酶活性提高了38.97倍。

Z7在镁限制条件下实现高效的RNP-DNA结合

机制研究表明，Z7变体编辑效率的提升与其在低镁条件下的稳定性密切相关。在体外切割实验中，当镁离子浓度降至生理相关的0.5 mM时，AtCas9-WT活性显著降低，而Z7仍保持高效切割。温度敏感性实验显示，在镁限制条件下，Z7在37°C仍能检测到活性，且最佳活性温度低于野生型。热位移实验表明Z7的熔解温度为46.6°C，与野生型的48.7°C相当，说明整体热稳定性保持良好。

电泳迁移率变动分析进一步揭示，Z7在低镁条件下能保持稳健的DNA结合能力，而野生型AtCas9的DNA结合能力显著降低。这表明环工程通过稳定镁限制条件下的RNP-DNA复合物来增强基因组编辑活性。

分子动力学模拟揭示AtCas9-Z7三元复合物特性

通过1微秒的分子动力学模拟，研究人员发现Z7变体呈现出更稳定的结构特征。与野生型相比，Z7的整体均方根波动较低，表明其具有增强的整体稳定性。重要动态区域分析显示，Z7中L2连接子和WED区域的灵活性增加，而RuvC-Ⅲ区域的灵活性降低，这种局部刚性化可能增强RNP-DNA的结合。

自由能景观分析表明，Z7占据更窄更深的自由能盆地，具有两个不同的能量最小值，表明构象异质性降低和更稳定的主导构象。结构分析发现Z7中结构域间距离显著缩短，特别是RuvC结构域与BH、REC1和REC2结构域之间的距离缩短了1.41?至4.58?，表明结构向更具催化能力的构象转变。

增强蛋白质-核酸亲和力提高编辑效率

为了进一步增强AtCas9与核酸的相互作用，研究人员通过精氨酸扫描和基于Nme1Cas9同源物的极性替代策略，筛选了16个位于DNA或sgRNA附近的残基。六个突变（F608N、P610K、P497R、E82R、N557R和V615R）显示出改善的A-to-G碱基编辑效率。结构建模表明，这些突变通过间接氢键和静电相互作用稳定异源双链。

通过逐步积累兼容突变，研究人员获得了编辑效率逐渐改善的变体。最终优化的At-E5116变体携带八个协同突变，在16个额外位点的平均编辑效率达到15.08%，中位数提高了2.25倍。

环移植与点突变结合进一步提升活性

将环工程与基于结构的工程相结合，研究人员发现Z7-E78变体表现出最高效率，比野生型提高5.76倍，比Z7提高2.06倍。在K562细胞中评估显示，Z7-E78在所有位点均表现出进一步改善的编辑效率，中位数比Z7提高2.65倍。

PAM兼容性测试表明，Z7和Z7-E78不仅提高编辑效率，还扩展了AtCas9-ABE的靶向范围。在含有非经典PAM的位点，Z7和Z7-E78表现出显著改善，在CNNB PAM位点总体提高8.07倍和8.57倍。

与SpRY-ABE的比较显示，Z7-ABE具有相当的编辑效率，而Z7-E78-ABE表现更优。编辑窗口分析发现，Z7-ABE和Z7-E78-ABE保持了更宽的编辑范围（位置5-11），而SpRY-ABE的编辑窗口相对较窄（位置3-7）。

特异性评估通过GUIDE-seq分析表明，Z7变体在保持高靶向特异性的同时，没有增加脱靶效应。在原发性人类T细胞中的实验进一步证明，Z7和Z7-E78在测试位点实现了2%-7%的编辑效率，而野生型编辑可忽略不计。

环工程策略改善其他嗜热Cas蛋白的活性

为验证环工程策略的普适性，研究人员将其应用于GeoCas9和ThermoCas9。将H8和V13环区域从Nme1Cas9移植到这两个嗜热同源物中，在HEK293T细胞中评估其活性。在含有经典CTAA PAM的位点，环工程变体显示出适度但可重复的改善。在含有非经典PAM的位点，环工程变体的编辑效率显著高于野生型对应物，GeoCas9变体效率达到5%-20%。

研究结论部分强调，环区域作为动态结构元件，其调控已成为优化Cas9功能的新策略。本研究通过将结构比对、进化筛选和机制理性相结合，证明靶向环工程可以提高编辑效率、扩展PAM兼容性并克服镁限制等生理约束。Z7变体通过稳定RNP-DNA结合和降低镁依赖性，在哺乳动物细胞中实现高效编辑。更重要的是，环工程策略可推广至其他嗜热Cas9同源物，展现出作为模块化策略优化Cas9基基因组编辑工具的广阔前景。

这项研究的创新之处在于将环工程这一蛋白质工程策略系统性地应用于Cas9优化，不仅开发出高性能的编辑工具，还深入揭示了其作用机制，为后续蛋白质工程设计提供了重要参考。环工程策略的成功应用，标志着CRISPR工具开发进入了一个更加精细和理性的新阶段，有望推动基因组编辑技术在基础研究和临床治疗中的更广泛应用。